1、基因轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染報(bào)告內(nèi)容報(bào)告內(nèi)容 一一 轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介 二二 轉(zhuǎn)染的分類(lèi)轉(zhuǎn)染的分類(lèi) 三三 轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染的方法 四四 轉(zhuǎn)染后篩選轉(zhuǎn)染后篩選一一 、 轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介 1.基因轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或?qū)⒕呱锕δ艿暮怂徂D(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。能研究和基因治療研究。二二 、轉(zhuǎn)染的分類(lèi)轉(zhuǎn)染的分類(lèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的目的快速分析快速分析為獲得穩(wěn)定表達(dá)外為獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的單細(xì)胞克源基因的單細(xì)胞克隆隆

2、目的目的DNA與宿主與宿主染色體染色體未整合未整合整合整合表達(dá)持續(xù)時(shí)間表達(dá)持續(xù)時(shí)間隨細(xì)胞分裂而稀釋隨細(xì)胞分裂而稀釋至丟失至丟失4872小時(shí)小時(shí) 隨宿主細(xì)胞本身基隨宿主細(xì)胞本身基因組一樣復(fù)制，轉(zhuǎn)因組一樣復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，并被穩(wěn)錄，翻譯，并被穩(wěn)定遺傳定遺傳 篩選辦法篩選辦法抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性三、轉(zhuǎn)染的方法三、轉(zhuǎn)染的方法 基因轉(zhuǎn)染的基本方法可以分為：基因轉(zhuǎn)染的基本方法可以分為： （1）重組子的構(gòu)建）重組子的構(gòu)建 （2）基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法）基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法重組子的構(gòu)建重組子的構(gòu)建1.目的基因的制備和獲取目的基因的制備和獲取2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)

3、載體的選擇3. DNA片斷的重組連接片斷的重組連接4. DNA重組體的鑒定重組體的鑒定1.目的基因的制備和獲取目的基因的制備和獲取(1)目的基因目的基因 是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段(2)目的基因常用的制備方法目的基因常用的制備方法 A.限制酶切除限制酶切除 a.從原核基因組從原核基因組DNA制備視原核基因制備視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。 b. 從真核基因組從真核基因組DNA制備制備 c.從已克隆的從已克隆的DNA片段制備片段制備B.B.

4、 PCRPCR或或RT/PCRRT/PCR方法制備目的基因方法制備目的基因a. 獲取已知基因獲取已知基因 據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知） 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)/ /合成一對(duì)引物合成一對(duì)引物 PCRPCR（基因組（基因組DNADNA為模板）為模板）/RT-PCR(mRNA/RT-PCR(mRNA為模板為模板) ) 從組織或細(xì)胞制備目的從組織或細(xì)胞制備目的基因基因b.b. 構(gòu)建構(gòu)建RT/PCRRT/PCR文庫(kù)法獲取未知基因文庫(kù)法獲取未知基因 據(jù)據(jù)mRNAmRNA末端如末端如polyApolyA尾設(shè)計(jì)共同引物尾設(shè)計(jì)共同引物 將所用將所用mRNAmRNA并逆轉(zhuǎn)錄成

5、并逆轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA利用工具酶在利用工具酶在cDNAcDNA末端加尾末端加尾 采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有cDNAcDNA，插入適當(dāng)載，插入適當(dāng)載體體 構(gòu)成構(gòu)成PCRcDNA文庫(kù)篩選文庫(kù)篩選C.計(jì)算機(jī)克隆計(jì)算機(jī)克隆即利用即利用GenBank信息，利用不信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴(lài)于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。片段，這有賴(lài)于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。D.化學(xué)合成法制備基因片段化學(xué)合成法制備基因片段用用DNA合成儀，合成儀，對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。

6、的目的基因。2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類(lèi)：質(zhì)粒型載體和病毒大類(lèi)：質(zhì)粒型載體和病毒型載體型載體（1）質(zhì)粒型載體）質(zhì)粒型載體 哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過(guò)細(xì)菌質(zhì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過(guò)細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。A. 典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件件: a.啟動(dòng)子啟動(dòng)子 b.增強(qiáng)子增強(qiáng)子 c. 多聚腺苷

7、酸化信號(hào)多聚腺苷酸化信號(hào) d. 藥物選擇藥物選擇標(biāo)記基標(biāo)記基e. 報(bào)告基因報(bào)告基因 f.表位標(biāo)簽表位標(biāo)簽B.B.常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體a. pcDNA3.la. pcDNA3.lb. pSIb. pSIc. pCMV-HAc. pCMV-HAd. pBudCE4.1d. pBudCE4.1e. pTREe. pTRE2 2）病毒型載體）病毒型載體 病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉椴《拘洼d體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類(lèi)載動(dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類(lèi)載體將來(lái)在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。目前

8、應(yīng)體將來(lái)在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。目前應(yīng)用的病毒類(lèi)型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒用的病毒類(lèi)型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。和桿狀病毒等。 A A逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異

9、常。一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常。B.腺病毒載體腺病毒載體 易于培養(yǎng)、純化，在感染過(guò)程中復(fù)制與易于培養(yǎng)、純化，在感染過(guò)程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較大的外源基因片段，且腺病毒基因不會(huì)發(fā)大的外源基因片段，且腺病毒基因不會(huì)發(fā)生整合，是研究真核基因的良好模型。生整合，是研究真核基因的良好模型。3.DNA片斷的重組連接片斷的重組連接粘端連接方法要點(diǎn)粘端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)單酶單切點(diǎn)單酶單切點(diǎn) 防自身環(huán)化，防自身環(huán)化，希望定向插入；希望定向插入；雙酶雙切點(diǎn)雙酶雙切點(diǎn) 定向克隆，構(gòu)定向克隆，構(gòu)建表達(dá)載體的最好用此法；建表達(dá)

10、載體的最好用此法；利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。端。平端，平端連接；平端，平端連接；Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接；連接酶切產(chǎn)生粘端連接；Adaptor銜接目的基因和載體；銜接目的基因和載體；同源同聚尾，克隆同源同聚尾，克隆cDNA的最好的最好方法方法T載體，載體，PCR產(chǎn)物產(chǎn)物T/A克隆克隆法連法連接接4. DNA重組體的鑒定重組體的鑒定外源外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子，而分子，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，我們所需要的基向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，

11、我們所需要的基因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒定定DNA重組體重組體（1） 酶切鑒定是必需的，基于下述酶切鑒定是必需的，基于下述: A. 限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。電泳圖譜不一樣。 B. 同一載體連接不同的同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載片斷，不同的載體連接同一片段體連接同一片段(片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的同的 。 C. 插入法插入法(單酶單切點(diǎn)單酶單切點(diǎn))或替

12、代法或替代法(雙酶雙位點(diǎn)雙酶雙位點(diǎn))酶切，一般來(lái)說(shuō)用酶切，一般來(lái)說(shuō)用3種限制酶切：種限制酶切： 可鑒定載體及可鑒定載體及 插入片段的大小插入片段的大小, ,方方向向, ,切后并電泳分析切后并電泳分析, ,以確定是否得到預(yù)期以確定是否得到預(yù)期的的rDNArDNA。2）若構(gòu)建）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因，重組體是為了克隆某個(gè)基因，可進(jìn)行在序列測(cè)定?？蛇M(jìn)行在序列測(cè)定。（3）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定?；蜣D(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染方轉(zhuǎn)染方 法法化學(xué)化學(xué) 轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染法物理物理 轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染法病毒病毒 感染法感染法DEAE一一葡聚糖

13、葡聚糖 法法顯微顯微注射注射 法法逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒磷酸鈣磷酸鈣 法法電穿孔電穿孔 法法腺病毒腺病毒人工人工脂質(zhì)體脂質(zhì)體 法法基因槍基因槍 法法(1).DEAE-(1).DEAE-葡聚糖葡聚糖 是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。一。DEAE-DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體, ,它與帶它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAEDEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開(kāi)一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開(kāi)始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。(2). (2). 磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法磷酸

14、鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法 由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNADNA和氯化鈣混合，然后加人到和氯化鈣混合，然后加人到PBSPBS中慢慢中慢慢形成形成DNADNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過(guò)胞膜的內(nèi)吞作液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過(guò)胞膜的內(nèi)吞作用攝人用攝人DNADNA。 （3）.脂質(zhì)體介導(dǎo)法（目前應(yīng)用最廣泛）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（目前應(yīng)用最廣泛） 【原理原理】：陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑與：陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑與DNA混合混合后，形成一種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物，后，形成一

15、種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物，DNA被包在脂質(zhì)體中間，這種脂質(zhì)雙層復(fù)被包在脂質(zhì)體中間，這種脂質(zhì)雙層復(fù)合物可直接加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，脂質(zhì)體粘合物可直接加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，脂質(zhì)體粘附到細(xì)胞表面并與細(xì)胞膜融合，附到細(xì)胞表面并與細(xì)胞膜融合，DNA被釋被釋放到胞漿中。放到胞漿中。 此圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它此圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。 【主要應(yīng)用主要應(yīng)用】:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 【特點(diǎn)特點(diǎn)】：使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段：使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類(lèi)型的裸露，通用于各種類(lèi)型的裸露DNA或或RNA，能

16、轉(zhuǎn)染各種類(lèi)型的細(xì)胞，沒(méi)有免疫原性。能轉(zhuǎn)染各種類(lèi)型的細(xì)胞，沒(méi)有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，很大程度上應(yīng)用受限制。很大程度上應(yīng)用受限制。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)量都是影

17、響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。巨大的作用。 此圖為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后熒光蛋白的表達(dá)此圖為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后熒光蛋白的表達(dá)物理方法物理方法包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。（1 1）電穿孔法）電穿孔法 利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于形成利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率重現(xiàn)性好，但需要較多

18、的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。必須找到的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn)。衡點(diǎn)。 (2(2）顯微注射法）顯微注射法 該法雖然費(fèi)力，但卻是非常有效的將核該法雖然費(fèi)力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。染細(xì)胞的研究。（3 3）基因槍法）基因槍法 該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用

19、于培養(yǎng)的細(xì)胞酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞。和在體的細(xì)胞。 病毒顆粒是一類(lèi)十分有效的基因釋放系統(tǒng)，病毒顆粒是一類(lèi)十分有效的基因釋放系統(tǒng)，因此，它是將外源基因?qū)舜罅考?xì)胞最有效的因此，它是將外源基因?qū)舜罅考?xì)胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來(lái)源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。用于各種不同來(lái)源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性，操作者需要有但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性，操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施。一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施。 （1 1）逆轉(zhuǎn)錄病毒）逆轉(zhuǎn)錄病毒 （2 2）腺病毒）腺病毒

20、四四 轉(zhuǎn)染后篩選轉(zhuǎn)染后篩選 篩選所選用的抗生素跟轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒上篩選所選用的抗生素跟轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒上所帶的真核篩選抗性基因有關(guān)的所帶的真核篩選抗性基因有關(guān)的 。 標(biāo)有標(biāo)有neo（實(shí)際上應(yīng)該是（實(shí)際上應(yīng)該是neo resistance）的載體，指載有降解新霉素的基因，新霉的載體，指載有降解新霉素的基因，新霉素作用于原核和真核細(xì)胞，對(duì)兩者都有殺素作用于原核和真核細(xì)胞，對(duì)兩者都有殺傷作用。用于轉(zhuǎn)染后，穩(wěn)定表達(dá)外源基因傷作用。用于轉(zhuǎn)染后，穩(wěn)定表達(dá)外源基因細(xì)胞的陽(yáng)性篩選。細(xì)胞的陽(yáng)性篩選。 標(biāo)有標(biāo)有amp（實(shí)際上應(yīng)該是（實(shí)際上應(yīng)該是amp resistance）的載體，指載有降解氨芐青霉素的基因（的載體，

21、指載有降解氨芐青霉素的基因（內(nèi)酰胺酶），作用于原核細(xì)胞，只對(duì)敏內(nèi)酰胺酶），作用于原核細(xì)胞，只對(duì)敏感菌有作用。用于克隆菌的篩選。感菌有作用。用于克隆菌的篩選。 最常見(jiàn)的載體上帶有新霉素抗性基因最常見(jiàn)的載體上帶有新霉素抗性基因neo，所以篩選的時(shí)候用所以篩選的時(shí)候用G418 。G418是目前獲是目前獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)最常用的試劑之一。得穩(wěn)轉(zhuǎn)最常用的試劑之一。 G418是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，其結(jié)構(gòu)與是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素，慶大霉素，卡那霉素相似，通過(guò)新霉素，慶大霉素，卡那霉素相似，通過(guò)影響影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核細(xì)胞等都有毒性，包括細(xì)菌

22、，原核和真核細(xì)胞等都有毒性，包括細(xì)菌，酵母，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生酵母，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)。細(xì)菌動(dòng)物和蠕蟲(chóng)。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列（轉(zhuǎn)座子序列（neo抗抗性基因）攜帶的氨基糖苷類(lèi)磷酸轉(zhuǎn)移酶可性基因）攜帶的氨基糖苷類(lèi)磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將以將G418轉(zhuǎn)變成無(wú)毒性狀。轉(zhuǎn)變成無(wú)毒性狀。 當(dāng)當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動(dòng)地方后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有

23、能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。目的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。目前前G418的這一特性已在基因轉(zhuǎn)移，敲除，的這一特性已在基因轉(zhuǎn)移，敲除，抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。應(yīng)用。 轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型（對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如染的細(xì)胞類(lèi)型（對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等。但無(wú)寡核苷酸、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等。但無(wú)論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)

24、性這幾個(gè)要染效率、低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素。素。 1 細(xì)胞細(xì)胞 （1）分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞）分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞 （2）貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞）貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞 （3）傳代次數(shù)）傳代次數(shù) （4）細(xì)胞數(shù)量（融合率）細(xì)胞數(shù)量（融合率） 2 交叉污染交叉污染 如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類(lèi)的細(xì)如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類(lèi)的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生