1、生物工程下游技術生物工程下游技術（四）（四） 初步純化初步純化 萃取（extraction） 吸附（absorption） 沉淀（precipitation）萃 取萃取的原理：利用在兩個互不相溶的液相中各種組分（包括目的 產物）溶解度的不同，從而達到分離的目的。萃取可提取和增濃產物，并可除去部分雜質 萃取包括溶劑萃取、超臨界流體萃取、雙水相萃取、反膠束萃 取和凝膠萃取等。溶劑萃取和超臨界流體萃取用于小分子物質 的萃取，雙水相萃取和反膠束萃取用于蛋白質等大分子的萃取。溶劑萃取-單級萃取實驗室操作 使含溶質的溶液和萃取劑接觸混合，靜止后分成兩層。 通常原料液是水溶液，萃取劑是有機溶劑，分層后，上層

2、為萃取相，下層為萃余相。 常用萃取溶劑：醇、酯、酮。雜質溶質原溶劑原溶劑萃取劑萃取劑Light phase,萃取液萃取液Heavy phase,萃余液萃余液萃取效率不高，產物在水相中含量仍較高。工業生產最常用的萃取流程工業生產最常用的萃取流程-多級萃取多級萃取多級逆流萃取萃取效率最高，萃取劑用量最少。多級逆流萃取萃取效率最高，萃取劑用量最少。多級逆流萃取工業裝置：多級逆流萃取工業裝置：超臨界流體萃取：超臨界流體萃取：物質的臨界狀態：其氣態和液態共存的一種邊緣狀態。超臨界流體：當一種物質處于其臨界點以上的溫度和壓力之下。萃取原理：超臨界流體具有象液體一樣的流動性和象氣體一樣的擴散 性，對物質具有

3、很好的溶解性。超臨界二氧化碳萃取 臨界點：T：31.1 P：7.4 MPa 操作（1）等溫變壓法：萃取了溶質的超臨界流體通過膨脹閥進入 分離槽，壓力下降，密度也下降，溶質溶解度下降而析出。 （2）等壓變溫法：萃取了溶質的超臨界流體經加熱器升溫后在 分離槽析出溶質。 （3）吸附法：萃取了溶質的超臨界流體通過吸附分離器（內含 只吸附溶質的吸附劑），使溶質與萃取劑分離。 優缺點：臨界條件溫和、產品分離簡單、CO2便宜、萃取后無殘留等。 但但設備投資大！ 雙水相萃取 反膠束萃取吸 附 吸附原理：用固體吸附劑吸附溶液中的目的物質或雜質。 普通吸附劑：活性炭、磷酸鈣、白陶土、硅藻土等。 活性炭：最常用的吸

4、附力很強的非極性吸附劑； 吸附能力： 極性基團多極性基團少 相對分子質量大 相對分子質量小 芳香族化合物脂肪族化合物 酸性溶液中吸附力強，pH=5離子交換吸附 吸附原理：樹脂上離子性功能團與溶液中的離子進行吸附。 樹脂種類：強酸、弱酸、強堿、弱堿。強堿性物質選用弱酸性樹脂，弱酸性物質選用強堿性樹脂。 過程：溶液加入經預處理的樹脂后進行吸附，吸附了目的物質的樹脂從溶液中分離，再把目的物質從樹脂上洗脫下來。洗脫條件與吸附條件相反。樹脂可再生。沉 淀 沉淀原理：利用沉淀劑使所需提取的生化物質或雜質在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。 沉淀方法：多價金屬離子聚電解質非離子型聚合物特殊沉淀劑

5、熱沉淀其他沉淀法有機溶劑沉淀等電點沉淀鹽析沉淀沉淀法鹽析（salting out）鹽析原理：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等生物大分子物質在水溶液中的溶解度降低，產生沉淀的過程。鹽析是可逆的！硫酸銨：溶解度大（25，767g/L，100%飽和度）過程：通常在攪拌下，以少量多次方式緩慢加入，待加入的硫酸銨溶 解后再加入少量的硫酸銨。鹽析沉淀后，需進行脫鹽處理，再 進行后續操作。脫鹽的方法 有透析（透析袋）、超濾。 透析只用于除鹽類和小分子雜質（五）（五） 精細純化精細純化 層 析 電 泳 層析：根據混合物中，溶質在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起溶質移動速度的不同而進行分離的方法。互

6、不相溶的兩相分別稱為：固定相和流動相。 層析又稱色譜或色層分離。屬高度純化技術。凝膠層析原理：在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經體積的不同， 使不同相對分子量的組分得以分離。亦稱分子篩層析。大分子先出來，大分子先出來，小分子后出來！小分子后出來！凝膠過濾介質葡聚糖葡聚糖凝膠：凝膠：商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯度越大，吸水性越小，G值越大，交聯度越小，吸水性就越大，二者呈反比關系。 瓊脂糖凝膠：瓊脂糖凝膠：商品名稱Sepharose、BioGel。化學穩定性較葡聚糖凝膠差。 聚丙烯酰胺凝膠層析：聚丙烯酰胺凝膠層析：商品名BioGel-P。化學穩定性好，有較高分辨率。分子

7、篩凝膠層析的優、缺點及應用 優點： 操作簡便，分離效果好，重復性高，回收率高、分離 條件溫和、規模放大容易、應用廣泛 缺點： 分辨率低（根據分子大小的差別） 洗脫后產品被稀釋 應用：脫鹽、相對分子量的測定Saltproduct親和層析l親和作用：生物分子間識別并結合的相應一種物質的特異性相互作用稱為親和作用。l親和層析的原理：將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與固體粒子或可溶性物質共價偶聯，特異性吸附或結合另一種分子，使另一種分子（目標物質）容易從混合物中得到選擇性分離純化。親和層析的操作載體活化、配基連接、吸附、清洗、洗脫、再生載體活化、配基連接、吸附、清洗、洗脫、再生親和層析的特點效率高

8、：利用親和吸附可以從粗提液中一次性分離得到高純度的活性物質。分離精度高：可用于分離含量極低，結構相近的化合物。但通用性較差，洗脫條件苛刻。五、精細純化 采用一些特殊的高新技術進一步把雜質與目的產物分離開來，包括層析、電泳、分子蒸餾等。5.1 層析層析 層析技術又叫色譜分離技術。 常見有紙層析、薄層層析、柱層析等。紙層析和薄層層析操作簡便，分辨率高，但分離量太少，主要用于定性和定量分析。柱層析進樣量大，回收容易，可用于分離純化。5.1.1 凝膠層析凝膠層析 凝膠層析是利用生物大分子的分子量差異進行的色譜分離的方法。 凝膠色譜介質主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的色譜介

9、質。目前已成為生物化工和生物制藥領域研究和生產中必不可少的分離介質。凝膠色譜基本原理凝膠色譜基本原理凝膠色譜介質是一種在球體內部具有大孔網狀結構的凝膠微粒，可以把大小不同的生物大分子按一定的順序進行分離，分子量大的生物分子由于不能進入或不能完全進入凝膠內部的網狀孔，沿著凝膠顆粒間的空隙或大的網狀孔通過，大分子相對于小分子遷移的路徑近，在柱內的停留時間短、保留值小，所以在色譜過程中遷移率最快，走在小分子的前面，先從色譜柱中流出。分子量小的分子由于能夠進入凝膠內部的網狀孔，沿著凝膠顆粒不同大小的網狀孔流過，相對于大分子的遷移路徑長，在柱內的停留時間長、保留值大，所以，在色譜過程中遷移率最慢，走在大

10、分子的后面，最后從柱中流出。樣品中分子量大小不同的各種分子在流過凝膠內部的網狀孔時就受到凝膠介質排阻效應，也稱為分子篩效應，將它們一個個分離，從而達到分離的目的。5.2 電泳電泳 原理是：蛋白質分子是兩性大分子，在一定的pH緩沖液中，蛋白質或帶正電，或帶負電，或在等電點不帶電。在電場作用下，帶正電荷的蛋白質向負極移動，帶負電的蛋白質向正極移動，處于等電點的蛋白質不移動。據此，可將兩性大分子分離開來。電泳技術有凝膠電泳、等電點聚焦電泳等。5.3 分子蒸餾分子蒸餾原理：液體分子受熱會從液面逸出，而不同種類的分子在氣相中運動的平均自由程不同來達到分離的目的。分子蒸餾的原理是根據分子運動理論，液體混合

11、物的分子受熱后運動會加劇，當接受到足夠能量時，就會從液面逸出而成為氣相分子。隨著液面上方氣相分子的增加，有一部分氣體就會返回液體。在外界條件保持恒定情況下，最終會達到分子運動的動態平衡。分子運動的平均自由程與分子的有效直徑的平方成反比。即分子有效直徑大的分子運動的平均自由程短，分子有效直徑小的分子運動的平均自由程大。此時如果在小分子能達到而大分子不能達到的距離上放一冷凝器，將小分子冷凝為液體，不斷從氣相中分離，平衡就被打破，液相混合物中的分子又會逸出成為氣相分子。只要時間足夠長，混合物就被分離提純了。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大

12、; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大 ; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分

13、子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大 ; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷

14、凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大 ; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從

15、而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大 ; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸

16、出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大 ; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中

17、的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運動平均自由程大 ; 重分子的分子運動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運動的平均自由程而大于重分子運動的平均自由程處，設置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出 ; 相反，氣相中的重分子因不能到達冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液

18、體混合物便達到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結構由加熱器、捕集器、高真空系統組成。六、成品加工 6.1 結晶技術 6.2 濃縮 6.3 干燥6.1結晶技術結晶技術結晶的目的就是為了獲得更純凈的固體的發酵產品。由于結晶過程具有高度選擇性，因此析出的晶體純度非常高。結晶的全過程應包括形成過飽和溶液、晶核形成和晶體生長等三個階段。溶液達到過飽和后，過量的溶質才會以固體態結晶出來。晶體的產生最初形成極細小的晶核，然后這些晶核再成長為一定大小形狀的晶體。一般，若在結晶過程中晶核的形成速率大于晶體的成長速率，則產晶中的晶體小而數目多；若晶核的形成速率小于晶體的成長速率，則產生的晶體大而數目少。6.2 濃縮濃縮 濃縮是將低溶質濃度的溶液通過除去溶劑變為高溶質濃度的溶液。它是發酵工業提取與精制過程中常用的單元操作。 發酵工業中常用的濃縮方法有蒸發濃縮法、冷凍濃縮法、吸收濃縮法等。冷凍濃縮法冷凍濃縮法 原理：是利用水溶液在共晶點前，部分水分呈冰晶析出的原理，來提高提取液的濃度。 冷凍的溫度越低，析出的冰晶越多，溶液的濃度也愈高。提取液的濃度要求，可由析出的冰晶數量（即去水量）來計算得出百分濃度。 冷凍濃縮系統可分為冷卻過程、冰結晶生成與長大的結晶過程及冰和濃縮液的分離過程。6.3 干燥干燥 干燥的主要目的是除去發酵