1、生物制藥學實驗生物制藥學實驗實驗實驗1-5 產淀粉酶菌株的篩選及誘變系列實驗產淀粉酶菌株的篩選及誘變系列實驗實驗需知實驗需知o 實驗分組：實驗分組：2個實驗室，每個實驗室分個實驗室，每個實驗室分6組（名組（名單上報）單上報），每次實驗結束留，每次實驗結束留1組同學值日組同學值日o 實驗成績：實驗成績：占期末總成績的占期末總成績的20%，包括，包括實驗出實驗出勤、實驗操作、實驗結果及實驗報告撰寫勤、實驗操作、實驗結果及實驗報告撰寫o 實驗結束：實驗結束：將實驗用品收拾整齊，由將實驗用品收拾整齊，由實驗老師實驗老師確認實驗結束確認實驗結束后方可離開后方可離開o 實驗報告：實驗報告：實驗目的、實驗原

2、理、實驗步驟實驗目的、實驗原理、實驗步驟（注意事項）、實驗結果、思考題（注意事項）、實驗結果、思考題系列實驗內容系列實驗內容o 實驗實驗1 土壤中產淀粉酶菌株的篩選土壤中產淀粉酶菌株的篩選 （1、2）o 實驗實驗2 產淀粉酶菌株的誘變劑量選擇產淀粉酶菌株的誘變劑量選擇 o 實驗實驗3 紫外誘變劑突變菌株的初篩紫外誘變劑突變菌株的初篩 o 實驗實驗4 紫外誘變劑突變菌株的復篩紫外誘變劑突變菌株的復篩 o 實驗實驗5 高產淀粉酶生產菌株的穩定性及淀粉酶高產淀粉酶生產菌株的穩定性及淀粉酶活力測定活力測定 背景知識背景知識淀粉酶（淀粉酶（amylase, Amy, AMS ）：）：o 能水解淀粉、糖原

3、和有關多糖中的能水解淀粉、糖原和有關多糖中的O-葡萄糖鍵葡萄糖鍵的酶的酶 o 藥物：助消化藥，治療功能性消化不良藥物：助消化藥，治療功能性消化不良背景知識背景知識o 產淀粉酶微生物：產淀粉酶微生物：細菌、真菌細菌、真菌等等o 菌種分離與篩選步驟：菌種分離與篩選步驟： 采樣采樣培養培養分離分離篩選篩選o 誘變育種步驟：誘變育種步驟： 誘變誘變初篩初篩復篩復篩性能檢測性能檢測背景知識背景知識實驗實驗1 土壤中產淀粉酶菌株的篩選（土壤中產淀粉酶菌株的篩選（1）實驗目的實驗目的o 掌握菌種分離與篩選的方法掌握菌種分離與篩選的方法o 從土壤中篩選出能夠合成分泌淀粉酶的微生物從土壤中篩選出能夠合成分泌淀粉

4、酶的微生物實驗原理實驗原理o 自然界微生物種類繁多，有些微生物能夠以自然界微生物種類繁多，有些微生物能夠以淀淀粉粉作為碳源進行生長繁殖，這是因為它們能夠作為碳源進行生長繁殖，這是因為它們能夠合成分泌合成分泌淀粉酶淀粉酶。o 當能合成淀粉酶的微生物在當能合成淀粉酶的微生物在含有淀粉的固體培含有淀粉的固體培養基養基中生長時，會將淀粉酶分泌到菌體周圍，中生長時，會將淀粉酶分泌到菌體周圍，使菌落周圍的淀粉水解成為小分子量的糊精、使菌落周圍的淀粉水解成為小分子量的糊精、聚糖和單糖。這些水解產物聚糖和單糖。這些水解產物不能與碘作用不能與碘作用，從，從而在菌體周圍形成而在菌體周圍形成透明圈透明圈。實驗步驟實

5、驗步驟 1. 篩選培養基的配制（已完成）篩選培養基的配制（已完成）o 可溶性淀粉可溶性淀粉2 g，NaCl 5 g，牛肉膏，牛肉膏5 g，蛋白胨，蛋白胨10 g，瓊脂，瓊脂20 g，水，水1000 mL。 2. 倒平板（每組倒平板（每組6個，每個平板個，每個平板10mL左右）左右）實驗步驟實驗步驟3. 土樣的采集土樣的采集o 各實驗室分別取各實驗室分別取三種三種不同環境的土樣并記錄當不同環境的土樣并記錄當時取樣環境情況（時取樣環境情況（1-2、3-4、5-6每兩小組在同每兩小組在同一個地方進行取樣），通常取一個地方進行取樣），通常取離地面離地面515cm處的土壤處的土壤。4. 稀釋分離稀釋分離

6、o 取土樣取土樣1 g，加入，加入9 mL無菌水，逐步稀釋至無菌水，逐步稀釋至105、106、107 （單數組）或（單數組）或106、107、108（雙數（雙數組）組） ，每個梯度涂，每個梯度涂2個平板。個平板。10ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml10-110-210-710-610-510-410-31ml1ml1ml1ml1ml稀 釋1ml分離分離實驗步驟實驗步驟5.各組做好標記，置于各組做好標記，置于30 恒溫培養恒溫培養48 h（倒置培養？倒置培養？）6. 產淀粉酶菌株的鑒定產淀粉酶菌株的鑒定（下次課）（下次課） 6. 產淀粉酶菌株的鑒定產淀粉酶菌株的鑒定p倒平皿（注意倒平

7、皿（注意培養基狀態、體積、表面平整培養基狀態、體積、表面平整）：）：3個個p用接種環挑取單菌落到無菌瓶皿上（用接種環挑取單菌落到無菌瓶皿上（點植法點植法：用接：用接種環在固體培養基表面接觸幾點），同時用簽字筆種環在固體培養基表面接觸幾點），同時用簽字筆按對應順序按對應順序對各單菌落進行標號。對各單菌落進行標號。p在原培養皿表面噴灑稀碘液，記錄在原培養皿表面噴灑稀碘液，記錄有水解圈有水解圈的單菌的單菌落，與此對應找出合成淀粉酶的菌株落，與此對應找出合成淀粉酶的菌株1-2株株。p注意：未分離得到菌落的小組可與其他組合作，挑注意：未分離得到菌落的小組可與其他組合作，挑取其他組鑒定得到的菌落進行后續實

8、驗（取其他組鑒定得到的菌落進行后續實驗（實驗報告實驗報告中注明使用哪一組的菌落中注明使用哪一組的菌落）。）。7. 產淀粉酶菌株的增殖培養產淀粉酶菌株的增殖培養o 液體培養基分裝：液體培養基分裝：10ml/瓶，每個菌株對應瓶，每個菌株對應1瓶瓶（每組每組1-2瓶，參考鑒定結果瓶，參考鑒定結果）o 液體培養基接種：用接種環從固體培養基表面上液體培養基接種：用接種環從固體培養基表面上沾取少許菌苔沾取少許菌苔，將接種環在液體培養基內，將接種環在液體培養基內振搖幾振搖幾次次即可。即可。o 做好標記，放入搖床中振蕩培養做好標記，放入搖床中振蕩培養24h。8. 產淀粉酶菌株的純化產淀粉酶菌株的純化平板劃線法

9、平板劃線法o 灼燒接種環灼燒接種環，冷卻后用接種環挑取少量菌苔，冷卻后用接種環挑取少量菌苔o 左手持平皿，將皿蓋打開一條縫隙，右手將接種左手持平皿，將皿蓋打開一條縫隙，右手將接種環伸入皿中，劃環伸入皿中，劃3-4條條平行線平行線o 灼燒接種環灼燒接種環，60旋轉平皿，劃線（注意：旋轉平皿，劃線（注意：后一后一區要求與前一區首尾相連，但不得與其他區域搭區要求與前一區首尾相連，但不得與其他區域搭在一起在一起）o 灼燒接種環灼燒接種環，將劃線平板倒置，于，將劃線平板倒置，于30培養培養48h后觀察。后觀察。 實驗結果及分析實驗結果及分析1. 取樣環境情況取樣環境情況2. 記錄記錄產淀粉酶菌株數量（比

10、透明圈？）產淀粉酶菌株數量（比透明圈？）及對及對菌落的菌落的初步鑒定結果初步鑒定結果3. 分析：從不同地點獲得的結果為什么會出現差分析：從不同地點獲得的結果為什么會出現差異？可以初步得出什么樣的結論？（異？可以初步得出什么樣的結論？（未分離出未分離出菌株的原因？菌株的原因？）細菌菌落特征細菌菌落特征o 較濕潤、光滑、透明、易挑取較濕潤、光滑、透明、易挑取o 菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致o 質地均勻、小而突起（或大而平坦）質地均勻、小而突起（或大而平坦）o 有臭味或酸敗味有臭味或酸敗味酵母菌菌落特征（與細菌相似酵母菌菌落特征（與細菌相似) o 圓形或卵

11、圓形圓形或卵圓形o 較濕潤、較粘稠、光滑，易挑取較濕潤、較粘稠、光滑，易挑取o 菌落質地均勻菌落質地均勻o 正反面、邊緣和中心顏色一致正反面、邊緣和中心顏色一致o 比細菌菌落大而厚，較不透明，顏色多呈乳白色比細菌菌落大而厚，較不透明，顏色多呈乳白色o 多帶酒香味多帶酒香味霉菌菌落特點霉菌菌落特點o 大而疏松，呈絨毛狀（曲霉）、絮狀（毛霉）、大而疏松，呈絨毛狀（曲霉）、絮狀（毛霉）、地毯狀（青霉）或蜘蛛網狀（根霉）地毯狀（青霉）或蜘蛛網狀（根霉）o 有的無固定大小，延至整個培養基中有的無固定大小，延至整個培養基中o 產色素，使菌落顯色產色素，使菌落顯色放線菌菌落特征放線菌菌落特征o 干燥、不透明

12、，小而緊密，呈放射狀干燥、不透明，小而緊密，呈放射狀o 菌落初期表面光滑或呈致密的絲絨狀，當產生菌落初期表面光滑或呈致密的絲絨狀，當產生孢子之后，其菌落表面呈粉狀、顆粒狀孢子之后，其菌落表面呈粉狀、顆粒狀o 菌落和培養基連接緊密，難以挑取，或者整個菌落和培養基連接緊密，難以挑取，或者整個菌落被挑起而不致破碎菌落被挑起而不致破碎o 菌落顏色多樣，菌落正反面顏色常不一致菌落顏色多樣，菌落正反面顏色常不一致o 帶有泥腥味帶有泥腥味思考題思考題1. 為什么要用淀粉作為碳源？為什么要用淀粉作為碳源？2. 為什么同一個土樣要稀釋不同梯度進行涂為什么同一個土樣要稀釋不同梯度進行涂平板？平板？實驗報告實驗報告o 本次實驗與上次實驗合寫一份實驗報告即可本次實驗與上次實驗合寫一份實驗報告即可o 實驗報告在實驗報告在本周六本周六實驗課時上交實驗課時上交注意注意o 每次實驗每次實驗課前課前5 5分鐘分鐘由各實驗室本次值日小組將實由各實驗室本次值日小組將實驗材料由準備室取出至各實驗室中驗材料由準備室取出至各實驗室中o