1、植物組織的植物組織的提取與鑒定提取與鑒定 張萍萍張萍萍分離純化核酸原則與要求分離純化核酸原則與要求1. 1.應保證核酸一級結構的完整性應保證核酸一級結構的完整性 完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的最基本完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的最基本要求要求) ) 2.2.排除蛋白質、脂類、糖類等其他分子的污染排除蛋白質、脂類、糖類等其他分子的污染 純化的核酸樣品不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑純化的核酸樣品不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑或過高濃度的金屬離子，蛋白質、脂類、多糖分子或過高濃度的金屬離子，蛋白質、脂類、多糖分子的污染應降低到最低程度；的污染應降低到最低程度； 無其他核酸分子

2、的污染，例如提取無其他核酸分子的污染，例如提取DNADNA分子時，應去分子時，應去除除RNARNA分子分子3.3.減少化學因素對核酸的降解減少化學因素對核酸的降解 避免過堿、過酸對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操避免過堿、過酸對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在作多在pH 4pH 41010條件下進行條件下進行4. 4. 減少物理因素對核酸的降解減少物理因素對核酸的降解 強烈振蕩、攪拌，將細胞突置于低滲液中，細胞裂解、強烈振蕩、攪拌，將細胞突置于低滲液中，細胞裂解、反復凍貯等造成的機械剪切力以及高溫煮沸等條件都反復凍貯等造成的機械剪切力以及高溫煮沸等條件都能明顯破壞大分子量的線性能明顯破壞大分子量

3、的線性DNADNA分子對于分子量小分子對于分子量小的環狀質粒的環狀質粒DNADNA及及RNARNA分子，威脅相對小一些分子，威脅相對小一些 。5. 5. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 細胞內、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核細胞內、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結構。酸的一級結構。DNADNA酶需要酶需要MgMg2+2+，CaCa2+2+的激活，因此的激活，因此實驗中常利用金屬二價離子螯合劑實驗中常利用金屬二價離子螯合劑EDTAEDTA，檸檬酸鹽，檸檬酸鹽，可基本抑制可基本抑制DNADNA酶的活性酶的活性 RNARNA酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸

4、酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸堿，不易失去活性，所以生物降解是堿，不易失去活性，所以生物降解是RNARNA提取過程的提取過程的主要危害因素。進行核酸分離時最好用新鮮生物組織主要危害因素。進行核酸分離時最好用新鮮生物組織或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應將材料貯存于或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應將材料貯存于液氮或一液氮或一7070的冰箱中。的冰箱中。DNADNA在細胞內的分布在細胞內的分布n核酸包括核酸包括DNADNA、RNARNA兩種分子，在細胞兩種分子，在細胞中都以與蛋白質結合的狀態存在。中都以與蛋白質結合的狀態存在。n真核生物的染色體真核生物的染色體DNADNA為雙鏈線性分

5、子，為雙鏈線性分子，原核生物的染色體原核生物的染色體DNADNA、質粒及真核細、質粒及真核細胞器胞器DNADNA為雙鏈環狀分子；有些噬菌體為雙鏈環狀分子；有些噬菌體DNADNA為單鏈環狀分子；為單鏈環狀分子； 9595的真核生物的真核生物DNADNA主要存在于細胞核內，主要存在于細胞核內，其他其他5 5為為細胞器細胞器DNADNA，如線粒體、葉綠體等，如線粒體、葉綠體等 RNARNA分子主要存在于細胞質中，約占分子主要存在于細胞質中，約占7575，另有，另有1010在細胞核中，在細胞核中，1515在細胞器中。在細胞器中。 大多數生物體內大多數生物體內RNARNA分子均為單鏈線性分子并具有不同分

6、子均為單鏈線性分子并具有不同的結構特點，如真核生物的結構特點，如真核生物mRNAmRNA分子多數在分子多數在3 3端帶有端帶有polyApolyA結構。結構。 DNADNA的性質的性質 DNADNA是很惰性的化學物質，雙鏈由氫鍵緊密相連，其堿是很惰性的化學物質，雙鏈由氫鍵緊密相連，其堿基對外側受磷酸和糖的保護，并由于其內部的堿基堆積基對外側受磷酸和糖的保護，并由于其內部的堿基堆積力而進一步加強，使力而進一步加強，使DNADNA在細胞內比其他成分更具化在細胞內比其他成分更具化學耐久性。學耐久性。 因此在氯仿等使蛋白質變性的條件下，因此在氯仿等使蛋白質變性的條件下，DNADNA分子仍然穩定。分子仍

7、然穩定。 真核生物中的染色體真核生物中的染色體DNADNA與堿性蛋白與堿性蛋白( (組蛋白組蛋白) )結合而成結合而成核蛋白核蛋白(DNP)(DNP)形式而存在于核內。形式而存在于核內。 DNADNA在乙醇中形成絮在乙醇中形成絮狀沉淀，使狀沉淀，使DNADNA最終得以分離最終得以分離真核生物基因組真核生物基因組DNADNA分離純化的基本步驟分離純化的基本步驟 真核生物的一切有核細胞真核生物的一切有核細胞( (包括培養細胞包括培養細胞) )都可以用來都可以用來制備基因組制備基因組DNADNA。提取方法包括兩步：。提取方法包括兩步： 1 1、先溫和裂解細胞及溶解、先溫和裂解細胞及溶解DNPDNP，

8、再使核蛋白解離，再使核蛋白解離，釋放出釋放出DNA.DNA. 真核細胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、勻漿真核細胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、勻漿法、法、液氮破碎法、液氮破碎法、低滲法等物理方法及蛋白酶低滲法等物理方法及蛋白酶K K和和去污劑去污劑溫和處理法，為獲得大分子質量的溫和處理法，為獲得大分子質量的DNADNA，一般多采用后者，一般多采用后者溫和裂解細胞。溫和裂解細胞。高分子質量高分子質量DNADNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，長而彎在物理上仍是易碎的，在溶液中，長而彎曲的曲的DNADNA分子隨機卷曲，并因堿基堆積力和磷酸分子隨機卷曲，并因堿基堆積力和磷酸 基團間基團間的

9、靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、攪拌等引的靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、攪拌等引起的流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組起的流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組DNADNA容易成片容易成片斷獲取，但所需分子質量越大，獲得的難度也相應增加，斷獲取，但所需分子質量越大，獲得的難度也相應增加，大于大于150 kb150 kb的的DNADNA分子在常規分離方法中多被切斷。分子在常規分離方法中多被切斷。 去除蛋白質常用酚、氯仿抽提，反復抽提操作對去除蛋白質常用酚、氯仿抽提，反復抽提操作對DNADNA鏈機鏈機械剪切機會較多，因此有人使用械剪切機會較多，因此有人使用8080甲酰胺解聚核蛋白聯甲

10、酰胺解聚核蛋白聯合透析的方法，可得小于合透析的方法，可得小于200 kb200 kb的的DNADNA片段。片段。 RNaseRNase消化去除消化去除RNARNA2. 2. 采用化學或酶學方法去除蛋白質、采用化學或酶學方法去除蛋白質、RNARNA及其及其他大分子他大分子小麥基因組小麥基因組DNADNA提取與鑒定提取與鑒定實驗目的實驗目的1學習植物基因組學習植物基因組DNA提取的原理。提取的原理。2熟悉并掌握基因組熟悉并掌握基因組DNA提取制備的基本技術。提取制備的基本技術。【實驗原理實驗原理】 脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNA）是一切生物細胞重要的組成）是一切生物細胞重要的組成成分，主要存在

11、于細胞核中，鹽溶法是提取成分，主要存在于細胞核中，鹽溶法是提取DNA的的常規技術之一。與動物細胞相比，植物細胞富含多常規技術之一。與動物細胞相比，植物細胞富含多酚、黃酮和多糖等次生代謝產物，這些物質易與酚、黃酮和多糖等次生代謝產物，這些物質易與DNA共沉淀而影響其分離純化。共沉淀而影響其分離純化。 CTAB法是目前植物基因組法是目前植物基因組DNA提取的首選方法，提取的首選方法，CTAB (十六烷三甲基溴化銨十六烷三甲基溴化銨)是一種陽離子去污劑，是一種陽離子去污劑，可使細胞膜破裂，并能與核酸形成復合物，在高鹽可使細胞膜破裂，并能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（溶液中（0.5M NaCI）是可

12、溶的，通過離心使）是可溶的，通過離心使CTAB-核酸復合物與植物多糖等雜質相分離。核酸復合物與植物多糖等雜質相分離。核酸提取液中含有核酸提取液中含有的蛋白質、多糖等可以的蛋白質、多糖等可以用沉淀分離法除去。用沉淀分離法除去。在核酸提取液中加在核酸提取液中加入氯仿入氯仿- -異戊醇或氯仿異戊醇或氯仿- -辛醇，振蕩一段時間，辛醇，振蕩一段時間，使蛋白質在氯仿一水界使蛋白質在氯仿一水界面上形成凝膠狀沉淀而面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在離心除去，核酸仍留在水溶液中。水溶液中。 核酸都不溶于有機溶劑，可在核酸提取液中核酸都不溶于有機溶劑，可在核酸提取液中加入親水有機溶劑（乙醇或異丙醇），使加

13、入親水有機溶劑（乙醇或異丙醇），使DNADNA或或RNARNA呈絮狀沉淀析出。而呈絮狀沉淀析出。而CTABCTAB因溶因溶于乙醇或異丙醇而除去。于乙醇或異丙醇而除去。 植物基因組植物基因組DNADNA提取的另一種常用方法是提取的另一種常用方法是SDSSDS提取法，提取法，SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）是強去（十二烷基硫酸鈉）是強去污劑，可使細胞膜及核膜破裂，同時也是一污劑，可使細胞膜及核膜破裂，同時也是一種強的蛋白變性劑，使蛋白質變性，與核酸種強的蛋白變性劑，使蛋白質變性，與核酸分離，從而從材料中提取出分離，從而從材料中提取出DNADNA。 【實驗材料實驗材料】1 1材料材料小麥葉片小麥葉片2

14、 2器材器材研缽，恒溫水浴鍋，高速冷凍離心機，離心管，液氮罐研缽，恒溫水浴鍋，高速冷凍離心機，離心管，液氮罐 3 3試劑試劑(2(2人人/ /組組) ) (1) 1mol/L TrisHCl(1) 1mol/L TrisHCl緩沖液緩沖液(pH 8.0)(pH 8.0)：12.1g Tris12.1g Tris溶于溶于80mL80mL重蒸水中，用濃鹽酸調節重蒸水中，用濃鹽酸調節pHpH至至8.08.0，用重蒸水定容，用重蒸水定容至至100mL100mL。 (2) 0.5mol/L EDTA(2) 0.5mol/L EDTA緩沖液緩沖液(pH 8.0)(pH 8.0)：取：取18.61g EDT

15、A-18.61g EDTA-Na2H2ONa2H2O用重蒸水用重蒸水80mL80mL溶解，然后用溶解，然后用NaOHNaOH調節調節pHpH至至8.08.0，加重蒸水至，加重蒸水至100mL100mL。 (3) PVP-10(3) PVP-10(聚乙稀吡咯烷酮聚乙稀吡咯烷酮) )【實驗材料實驗材料】3 3試劑試劑(2(2人人/ /組組) )n(4)(4)氯仿氯仿- -異戊醇溶液異戊醇溶液(24:l ,V/V) (24:l ,V/V) ，現配現用。，現配現用。n(5) 70%(5) 70%乙醇乙醇n(6) 1(6) 1TETEn(7)(7)無水乙醇或異丙醇無水乙醇或異丙醇n(8) RNase A

16、(8) RNase A (9) CTAB(9) CTAB提取緩沖液提取緩沖液(100ml)(100ml)1M Tris HCl (pH8.0) 10ml1M Tris HCl (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10mlNaCI 3.27gNaCI 3.27gPVP-10 1.0gPVP-10 1.0gCTAB 2.0gCTAB 2.0gddHddH2 2O O 定容至定容至 100ml100ml6565溶解，使用前加巰基乙醇溶解，使用前加巰基乙醇2ml2ml。【實驗材料實驗材料】 (10) SDS(10) SDS提取緩沖液提

17、取緩沖液(100ml)(100ml)1M Tris HCl (pH8.0) 10ml1M Tris HCl (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10mlNaCI 2.92gNaCI 2.92g偏重亞硫酸鈉偏重亞硫酸鈉 0.380.38SDS 1.25gSDS 1.25gddHddH2 2O O 定容至定容至 100ml100ml6565溶解，使用前加巰基乙醇溶解，使用前加巰基乙醇2ml2ml。【實驗材料實驗材料】【實驗方法實驗方法】1 1取取30ml30ml離心管中，加入約離心管中，加入約8ml SDS8ml SDS提取提取緩

18、沖液，水浴鍋中預熱至緩沖液，水浴鍋中預熱至6565，取，取2 24g4g新鮮葉片于研缽中，加人液氮充分研磨新鮮葉片于研缽中，加人液氮充分研磨成粉末，移入成粉末，移入30ml30ml離心管中（樣品的量離心管中（樣品的量為提取液量的為提取液量的1/2-2/31/2-2/3） 。充分混勻，置。充分混勻，置6565水浴水浴1h1h。每隔。每隔10-1510-15分鐘搖勻一次。分鐘搖勻一次。 2. 2. 取出，冷卻至室溫，加入取出，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿等體積的氯仿- -異戊醇溶液異戊醇溶液(24:l ,V/V) 12mL(24:l ,V/V) 12mL，上下劇上下劇烈振蕩烈振蕩1- 1-2min

19、2min （互溶即（互溶即可），可），使組蛋白分離，于使組蛋白分離，于4000r/min4000r/min，離心，離心l5minl5min，吸，吸出上面含有出上面含有DNADNA的水層，的水層，棄去兩層間的變性蛋白凝棄去兩層間的變性蛋白凝膠，回收下層有機相。膠，回收下層有機相。【實驗方法實驗方法】 3. 3. 將上清液轉入另一將上清液轉入另一30ml30ml離心管中，在上清液中加入離心管中，在上清液中加入2 2倍倍體積冰無水乙醇或異丙醇，輕緩顛倒混勻，出現絮狀沉體積冰無水乙醇或異丙醇，輕緩顛倒混勻，出現絮狀沉淀，淀， -20-20放置放置30min30min或或-80-80放置放置10min1

20、0min。 4 4用槍頭鉤出用槍頭鉤出DNADNA或或4000 r/min4000 r/min離心離心15 min15 min，去上清液，去上清液，回收回收DNADNA沉淀。沉淀。 5 5沉淀用沉淀用7070乙醇洗滌乙醇洗滌1 1次。轉移至次。轉移至2mL EP2mL EP管中，晾干管中，晾干或在超凈工作臺上吹干。或在超凈工作臺上吹干。 6 6吹干的吹干的DNADNA溶于適量的溶于適量的 TETE（0.2-1ml0.2-1ml）緩沖液中，完）緩沖液中，完全溶解后加入全溶解后加入10l RNase A10l RNase A，3737保溫保溫30 min30 min消化消化RNARNA。【實驗方法

21、實驗方法】【注意事項注意事項】 1 1研磨好的植物材料細粉末在轉入離心管之前不要讓它研磨好的植物材料細粉末在轉入離心管之前不要讓它融化。融化。 2 2提取過程中機械力可導致大分子提取過程中機械力可導致大分子DNADNA的斷裂，為保證的斷裂，為保證DNADNA的完整性，各步操作均應較溫和，避免劇烈震蕩。液的完整性，各步操作均應較溫和，避免劇烈震蕩。液氮研磨時，不宜過于劇烈；氮研磨時，不宜過于劇烈；除去蛋白質時，若振蕩劇烈可除去蛋白質時，若振蕩劇烈可使部分使部分DNADNA斷裂，乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的斷裂，乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的纖維狀纖維狀DNADNA外，溶液中還會有絮狀沉

22、淀，即為斷裂的外，溶液中還會有絮狀沉淀，即為斷裂的DNADNA。但若振蕩不夠，蛋白質不能很好除去，則影響。但若振蕩不夠，蛋白質不能很好除去，則影響DNADNA制品的質量。制品的質量。 3. 3. 為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，使其分子斷為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，使其分子斷裂，因而不能獲得天然的大分子核酸。提取中需要加人裂，因而不能獲得天然的大分子核酸。提取中需要加人EDTAEDTA、檸檬酸鈉檸檬酸鈉、8- 8-羥基喹啉等羥基喹啉等抑制核酸酶的活力抑制核酸酶的活力，并，并在在低溫低溫下進行操作，此外提取過程中應避免加熱，強酸，下進行操作，此外提取過程中應避免加熱，強酸，強堿和

23、劇烈振蕩等。強堿和劇烈振蕩等。 4 4CTABCTAB或或SDSSDS溶液在低于溶液在低于1515時會析出沉淀，因此在時會析出沉淀，因此在加入冷凍的植物材料前必須預熱，離心溫度也應保持不加入冷凍的植物材料前必須預熱，離心溫度也應保持不低于低于1515。 5 5植物組織由于多酚類化合物含量較高，會使溶液出現植物組織由于多酚類化合物含量較高，會使溶液出現褐變現象，如果材料中色素物質特別多，可適當提高抽褐變現象，如果材料中色素物質特別多，可適當提高抽提緩沖液中的巰基乙醇濃度至提緩沖液中的巰基乙醇濃度至2%2%5%5%，或增加，或增加PVPPVP的用的用量至量至2%2%；多糖含量太高的材料，可在使用前

24、將組織冷藏；多糖含量太高的材料，可在使用前將組織冷藏或冷凍保存。或冷凍保存。 為避免大分子為避免大分子DNADNA的斷裂，槍頭在使用前需圓口。的斷裂，槍頭在使用前需圓口。【注意事項注意事項】思考題1. 1.為什么在低溫下進行？為什么在低溫下進行？2. 2.加加EDTAEDTA或檸檬酸鈉的作用或檸檬酸鈉的作用 ? ?3. 3.加入異戊醇有什么作用？加入異戊醇有什么作用？4. 4.分離純化過程中每一步試劑的作用？分離純化過程中每一步試劑的作用？l實驗室：實驗室： 207室室 209室室l領用儀器：領用儀器： 211室室l純水機：純水機： 207室室 209室室l離心機：離心機： 209室一臺室一臺

25、 103室一臺室一臺l分光光度計室：分光光度計室：108室室DNA的鑒定與分析紫外吸收法測定紫外吸收法測定DNADNA純度和含量純度和含量瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測DNADNA分子大小分子大小與完整性與完整性DNA的鑒定與分析紫外吸收法測定紫外吸收法測定DNADNA純度和含量純度和含量瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測DNADNA分子大小分子大小與完整性與完整性二苯胺顯色法測定二苯胺顯色法測定DNADNA含量含量紫外吸收法測定紫外吸收法測定DNADNA純度和含量純度和含量核酸在核酸在260nm260nm波長處具有紫外吸收特性波長處具有紫外吸收特性( (最大吸收峰最大吸收峰) )。此

26、法快速、。此法快速、簡便，且不破壞樣品，是定量測定濃度較高的純簡便，且不破壞樣品，是定量測定濃度較高的純DNADNA和和RNARNA溶液溶液的首選方法。的首選方法。高純度高純度DNADNA制品的制品的260nm260nm與與280nm280nm的吸光值的比值在的吸光值的比值在1.81.8左右左右，當，當比值偏高時表明制品中混雜有比值偏高時表明制品中混雜有RNA,RNA,而比值偏低時則表明制品中可而比值偏低時則表明制品中可能有蛋白質或酚的污染。能有蛋白質或酚的污染。因此，可利用因此，可利用A260/A280A260/A280比值的測定來鑒定比值的測定來鑒定DNADNA制品的純度制品的純度。【實驗

27、原理實驗原理】1 1取取DNADNA溶液溶液2ul2ul，用，用0.010.01mol/Lmol/L的氫氧化鈉溶液定容至的氫氧化鈉溶液定容至300ul300ul，轉入，轉入0.5mL0.5mL的石英比色杯中。的石英比色杯中。2 2用用300ul 300ul 0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH校正紫外分光光度計的零點。校正紫外分光光度計的零點。3 3在在260nm260nm，280nm280nm處分別讀出吸光度值處分別讀出吸光度值(A)(A)。定量分析：定量分析：DNADNA的濃度的濃度=A260=A260核酸稀釋倍數核酸稀釋倍數505010001000 =A260 =A2

28、60150150505010001000 =7.5 =7.5A260(g/l)A260(g/l) RNA RNA的濃度的濃度=A260=A260核酸稀釋倍數核酸稀釋倍數40401000 (g/l)1000 (g/l)【實驗步驟】 分光光度換算：分光光度換算： 1A2601A260雙鏈雙鏈DNA=50g/ml DNA=50g/ml 1A2601A260單鏈單鏈DNA=30g/ml DNA=30g/ml 1A2601A260單鏈單鏈RNA=40g/mlRNA=40g/ml 注意 將DNA樣品稀釋到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之間再測A260、A280及計算A260/A280比值，因為

29、只有在此范圍內才有線性關系，可先用原液測定，再估算稀釋比例。4 4純度分析：純度分析：若為若為DNADNA純品，則純品，則A260A260A280=1.8A280=1.8 若為若為RNARNA純品，則純品，則A260A260A280=2.0A280=2.0 若若DNADNA樣品樣品A260A260A2801.8A2801.8，說明仍有，說明仍有RNARNA，可用，可用RNARNA酶處理酶處理樣品；若樣品；若A260A260A280l.7A280l.7，說明樣品中存在蛋白質，應再用酚，說明樣品中存在蛋白質，應再用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀純化氯仿抽提，乙醇沉淀純化DNADNA。 若為若為RNAR

30、NA樣品樣品A260A260A2802.0A2802.0，也應考慮再用酚，也應考慮再用酚/ /氯仿抽提。氯仿抽提。 若核酸樣品若核酸樣品A260A260A2302.0A23010V/cm)(10V/cm)，所以選擇一個有，所以選擇一個有相對較大的緩沖槽比較有利。相對較大的緩沖槽比較有利。【注意事項注意事項】二苯胺顯色法測定二苯胺顯色法測定DNADNA含量（三）含量（三） 強酸、加熱條件下，可以使強酸、加熱條件下，可以使DNADNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，而產生嘌呤堿基，糖苷鍵斷裂，而產生嘌呤堿基，脫氧核糖脫氧核糖與嘧啶核苷酸。與嘧啶核苷酸。 其中其中22

31、脫氧核糖在酸性環境中成為脫氧核糖在酸性環境中成為羥基羥基酮基戊醛，酮基戊醛，此物與二苯胺反應生成此物與二苯胺反應生成藍色化合物藍色化合物，在，在595595nmnm處有最大吸收。處有最大吸收。DNADNA在在40-40040-400g/mlg/ml范圍內光密度與范圍內光密度與DNADNA濃度成正比。濃度成正比。 在反應液中加入在反應液中加入少量乙醛可提高靈敏度少量乙醛可提高靈敏度，而且其他化合物的干，而且其他化合物的干擾也顯著降低。擾也顯著降低。 當樣品含少量當樣品含少量RNARNA時不影響測定，而蛋白質、多種糖及其衍生時不影響測定，而蛋白質、多種糖及其衍生物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有

32、色物質，干擾測定。物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有色物質，干擾測定。【實驗原理實驗原理】1 1、DNADNA標準溶液：標準溶液：（須經定磷法確定其濃度）取標準（須經定磷法確定其濃度）取標準DNADNA以以0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH配成配成200200微克微克/ /毫升的標準液。毫升的標準液。 每組需每組需1212.4ml.4ml，200ml/200ml/班班2 2、待測樣品液：待測樣品液：取取DNADNA溶液？溶液？ul ul，用，用0.010.01mol/Lmol/L的氫氧化的氫氧化鈉溶液定容至鈉溶液定容至5ml5ml配成配成100100微克微克/ /毫升的

33、溶液。毫升的溶液。 每組需每組需7ml7ml3 3、二苯胺試劑：、二苯胺試劑：1g1g二苯胺二苯胺 （需在（需在70%70%乙醇試劑中重結晶乙醇試劑中重結晶2 2次次) ) +100 mL+100 mL冰乙酸冰乙酸+10 mL+10 mL過氯酸，混合備用，過氯酸，混合備用，臨用前加臨用前加入入1.0 mL1.6%1.0 mL1.6%乙醛。乙醛。 每組需每組需64ml,1000ml/64ml,1000ml/班班4 4、1.6%1.6%乙醛：乙醛：取取47%47%乙醛乙醛3.43.4mlml，加重蒸水定容至加重蒸水定容至100100mlml（放于冰箱中，一周之內可以使用）。放于冰箱中，一周之內可以使用）。注意：商品用有注意：商品用有47%47%和和4 40%0%兩種兩種 1. 1. DNADNA標準曲線的制定：標準曲線的制定： 取取1 14 4支試管，分成支試管，分成2 2組，依次加入組，依次加入0 0、0.20.2、0.40.4、0.80.8、1.21.2、1.61.6和和2.02.0mlDNAmlDNA標準溶液。