1、基因定點突變一、定點突變的目的把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。二、定點突變的原理通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產物，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。三、引物設計原則引物設計的一般原則不再重復。突變引物設計的特殊原則：（1）通常引物長度為2545 bp，我們建議引物長度為3035 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引

2、物搭上，所以兩邊最好各設至少12個bp，并且合成多一條反向互補的引物。 （2）如果設定的引物長度為30 bp，接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78（GC含量應大于40%）。 （3）如果Tm值低于78，則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78（GC含量應大于40%）。 （4）設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。 （5）最好使用經過純化的引物。       Tm值計算公式：Tm=0.41×(% of GC)675/L+81.5 注：L：引物堿基數；% of GC：引物GC含量。四、引物設計實例以GCGACG為例：5

3、-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3（1）首先設計30 bp長的上下游引物，并將A (T)設計在引物的中央位置。Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過計算可以看出其Tm低于78，這樣的引物是不合適的，所以必須調整引物長度。（3）重新調整引物長度。Primer #

4、1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 Primer #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變實驗了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K，所以要用

5、那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。除了使用基因定點突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。六、如何去掉PCR產物最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質粒）而不

6、會影響PCR產物，從而去掉模板留下PCR產物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。七、如何拿到質粒直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質粒，拿去測序，驗證突變結果。八、圖示九、定點突變操作步驟A 誘導突變基因（PCR反應）以待突變的質粒為模板，用設計的引物及Muta-direct酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。1. 設計點突變引物。  注參考引物設計指導2. 準備模板質粒D

7、N A注用dam+型菌株（例如DH5菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數低的現象，但是對突變效率沒有影響。提取質粒DNA時我們建議您使用本公司的質粒提純試劑盒。3. 選項對照反應體系（50l反應體系）10×Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid（10ng/l，total 20ng）2lControl primer mix（20pmol/l）2ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O 38lMuta-direct Enzyme1l4. 樣品反應體系（50l反應體系）10×Reaction Buffer5lS

8、ample plasmid（10ng/l，total 20ng） 2lSample primer (F)（10pmol/l）1lSample primer (R)（10pmol/l）1ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5. PCR反應條件注按如下參數設置PCR擴增條件。CyclesTemperature Reaction Time1cycle95 30sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR擴增反應完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復凍融）。注 按

9、下列提供的PCR條件進行擴增，控制PCR循環數。注意當突變點位點超過4個時會發生突變率降低的現象。MutationCycles 12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB 突變質粒選擇PCR反應結束后使用Mutazyme酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。1. 準備PCR反應產物2. 加入1l（10U/l）Mutazyme酶37溫育1小時。注當質粒DNA用量過多時Mutazyme酶可能發生與樣品反應不完全的現象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低，可以適當延長反應時間或增加Mutazyme酶用量。C轉化反應完畢后在質粒DNA上會產生缺口，當