1、期末考試復習題吸附法和離子交換1、吸附作用機理是什么？按作用力可分為哪幾種？答：固體表面分子（或原子）處于特殊的狀態。固體內部分子所受的力是對稱的，故彼此處于平衡。但在界面分子的力場是不飽和的，即存在一種固體的表面力，它能從外界吸附分子、原子、或離子，并在吸附表面上形成多分子層或單分子層。按作用力可分為：物理吸附，化學吸附和離子交換2、吸附法有幾種？各自有何特點？答：吸附法按吸附作用力分主要有三類，物理吸附、化學吸附和離子交換。特點：物理吸附基于吸附劑與溶質之間的分子間作用力即范德華力。溶質在吸附劑上吸附與否或吸附量的多少主要取決于溶質與吸附劑極性的相似性和溶劑的極性。一般物理吸附發生在吸附劑

2、的整個自由表面，被吸附的溶質可通過改變溫度、PH和鹽濃度等物理條件脫附。化學吸附釋放大量的熱，吸附熱高于物理吸附。化學吸附一般為單分子層吸附，吸附穩定，不易脫附，故洗脫化學吸附質一般需采用破壞化學結合的化學試劑為洗脫劑。化學吸附具有高選擇性離子交換吸附所用吸附劑為離子交換劑。離子交換劑表面含有離子基團或可離子化基團，通過靜電引力吸附帶有相反電荷的離子，吸附過程發生電荷轉移。離子交換的吸附質可以通過調節PH或提高離子強度的方法洗脫。3、大孔網狀聚合物吸附與活性炭吸附劑相比有何優缺點？答：大孔網狀聚合物吸附劑機械強度高，使用壽命長，選擇性能好，吸附質容易吸附，并且阻力小，常應用于抗生素和維生素B1

3、2等的分離濃縮過程。4、影響吸附過程的因素有那些？答：影響吸附的因素(1)吸附速度由于大分子分子量大，擴散慢，且吸附時常伴隨著分子構型的變化，故其吸附速度慢，這就給討論大分子吸附帶來困難。(2)分子量的影響對孔性固體，分子量增加，吸附量減少。對大孔或非孔固體口=1只有1個吸附點a=昧示大分子完全平躺。(3)溶劑的影響在溶劑中，大分子較伸展，吸附量減少。若溶劑產生競爭吸附，吸附量減少。(4)溫度的影響存在著溫度升高使吸附量下降和溫度升高使吸附量升高兩種情況。第二種情況可認為吸附是吸熱過程H>o,但GvQ故$必大于零，這可認為大分子的吸附頂替了固體表面上的溶劑分子(第一種情況可認為是始控制)

4、。(5) PHS活性炭一般在酸性溶液中比在堿性溶液中吸附效果較好。(6)共存物質：對于物理吸附，共存多種物質時的吸附比單一物質時的吸附要差。(7)吸附劑性質的影響(a)溶解度：越低越容易吸附，具有較大的影響。(b)使液體表面自由能V悔低得越多的吸附質則越容易被吸附。(c)極性：極性吸附劑易吸附極性的吸附質，非極性吸附劑易吸附非極性的吸附質。(d)吸附質分子的大小和不飽和度。活性炭易吸附分子直徑較大的飽和化合物；合成沸石易吸附分子直徑小的不飽和化合物(e)吸附質的濃度較低時，提高CM增加吸附量。以后CT,q增加很小，直至為一定值5、何謂離子交換法？一般可分為那幾種？答：離子交換吸附：吸附劑為離子

5、交換劑，離子交換劑表面含有離子基團或可離子化基團，通過靜電引力吸附帶有相反電荷的離子，吸附過程中發生電荷轉移，離子交換的吸附質可通過調節PHE提高離子強度的方法洗脫。根據吸附過程中所發生的吸附質一吸附劑之間的相互作用的不同，還可將吸附分成親和吸附、疏水吸附、鹽析吸附和免疫吸附等。6、離子交換樹脂的結構、組成？按活性基團不同可分為那幾大類？離子交換劑通過化學修飾制備，主要有苯乙烯-二乙烯苯型、丙烯酸-二乙烯苯型、酚醛型和多乙烯多胺-環氧氯丙烷型樹脂。這些交換劑附著在離子交換劑基質上。應用于無機離子交換和生物小分子回收、提取的離子交換劑疏水性高、交聯度大、孔徑小、電荷密度高；應用于蛋白質分離的具有

6、很高的親水性和較大的孔隙半徑，以減少蛋白質的非特異性吸附，是蛋白質容易進入離子交換劑的內部。按活性基團的不同，可分為：活性基團為酸性的陽離子交換劑和活性基團為堿性的陰離子交換劑。7、離子交換樹脂有那些理化性能指標？答：(1)交換容量(exchangecapacity)指單位質量的干燥離子交換劑或單位體積的濕離子交換劑所能吸附的一價離子的毫摩爾數(mmol),是表征交換劑離子交換能力的主要參數。PS:交換容量的測定：對于陽離子交換劑：用HCl將其處理成氫型，稱重并測定其含水量；稱數克交換劑，加入到過量已知濃度的NaOH容液，發生交換反應，待反應達到平衡后（強酸性的需要靜置24h,弱酸性的需靜置數

7、日），測定剩余的NaOH»爾數，就可求得陽離子交換劑的交換容量。對于陰離子交換劑：將陰離子交換劑轉換成Cl型后，取一定量的Cl型交換劑，通入Na2SO4用銘酸鉀作指示劑，用硝酸銀溶液滴定流出液的Cl-,根據Cl-量計算交換容量。（2）滴定曲線（全面評價表征交換劑的重要參數）方法：1g氫型（或羥型）交換劑+x-ml0.1MNaOH/orHCl+水至50ml（其中1支+50ml0.1MNaCl）+靜置24h（對強交換齊）/or7d（對弱交換齊）+測pH+作圖意義：強酸（堿）性離子交換的滴定曲線開始是水平的，到某點突然升高（或降低），表明在該點交換劑上的離子交換基團已被堿（或酸）完全飽和；

8、弱酸（或堿）性離子交換劑的滴定曲線逐漸上升（或下降），無水平部分。利用滴定曲線的轉折點，可估算離子交換劑的交換容量；而由轉折點的數目，可推算不同離子交換基團的數目。8、pH值是如何影響離子交換分離的？XH,KaxX-HmX_=RX-X-XHKxuRU-KaxmXr_U1KaxH可見當PH值增大時弱電解質的離子交換的分配系數增大，而對強電解質沒有影響，可從下式看出mx=RX-X1mx_=KxU_RU-.U-9、何謂穿透曲線？答：穿透曲線（1）吸附帶：指正在發生吸附作用的那段填充層，在吸附帶下部的填充層幾乎沒有發生吸附作用，而在吸附帶上部的填充層已達到飽和狀態，不再起吸附作用。（2）穿透曲線：以吸

9、附時間或吸附柱出水總體積為橫坐標，以出水吸附質濃度為縱坐標所繪制出的曲線叫穿透曲線。另解：吸附過程中吸附塔出口溶質濃度的變化曲線穿透曲線(3)穿透點：出口處溶質濃度開始上升的點成為穿透點。達到穿透點所用的操作時間稱為穿透時間。一般習慣上將出口濃度達到入口濃度的5%10%的的時間成為穿透時間。(4)吸附終點：出水濃度CM(0.900.95)Co時所對應的出水總體積的穿透曲線上的那一點叫吸附終點(耗竭點)。色層分離1、何謂色層分離法？可分為那幾大類？答：色層分離法：又稱層析分離法，色譜法，是利用混合物中各物質在兩相間分配系數的差別，當溶質在兩相間做相對移動時，各物質在兩相間進行多次分配從而是各組分

10、達到分離的一種物理化學分析方法。2、簡述柱層析系統的工藝流程。答：層析柱通常是玻璃的。總的說來，長柱分辨好。但大量物質的處理則用粗的柱比較適宜。工藝流程如下：(1)層析材料的準備許多材料都可在層析法中使用。在裝柱前這些材料要用溶劑平衡，另外還需作一些預處理。例如，凝膠層析材料需要溶脹，吸附劑需要加熱或酸處理來活化，離子交換樹脂需要用酸堿處理來得到所需的電離形式。在用溶劑平衡時，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細顆粒，否則由于細顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低(2)裝柱層析柱的填裝是先關閉出口，用溶劑灌注至1/3#積，并使支持板下的“死體積”不存有氣泡，再慢慢地向溶劑中加漿狀物，要小心地沿著玻棒

11、傾注以防止氣泡存留在拄內。讓懸浮液沉淀，并放出過多的溶劑。為了避免分層，最好一次裝完，如需分幾次填裝，則在二次填裝前應先在已經沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復這個過程，直至裝到需要的高度。用溶劑徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點。最后覆蓋一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時擾亂床表面。(4)加樣上柱前，先將樣品溶解在溶劑里或對洗脫液透析，樣品溶液的濃度應該盡可能高些，以減少樣品溶液體積，使區帶狹窄。將樣品仔細加到層析床的表面，打開旋塞至液面與床面齊，然后連接溶劑池，保持一定高度的液面。(5)洗脫用適當的洗脫液把各組分依次從柱上洗脫下來。使用洗脫法，上柱量不超過總柱容量的10%,溶劑與

12、柱的相互作用比溶質與柱的相互作用弱，溶劑越過結合的分子，逐漸地將它們從柱上沖洗下來。在沖洗過程中各組分因為吸附力不同而逐漸分離。在一個組分被洗脫后可以更換洗脫液，這就是所謂的分步洗脫。另外,還有一個可行的方法是逐漸改變溶劑的性質，形成一個離子強度、pH£極性的遞增梯度從而使各組分依次被洗脫，這種方法稱梯度洗脫，它的優點之一是能夠減少拖尾現象。(6)部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列試管中或使用部分收集器。這種裝置能使每一管按照預定的時間或滴數收集流出液，然后自動移位，下一管再繼續收集。洗脫完畢后可選用各種適宜的方法將已收集的許多部分流出液進行定量分析，并畫出洗脫物的

13、量對流出液體積的洗脫曲線。每一部分的蛋白質或核酸的含量可以讓流出液通過一個流動小室測定其280nnm£260nnt勺光吸收來進行連續監測。3、何謂保留值、分配容量K、分離度？答：1)保留值(1)死時間to不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積。因為這種物質不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速U時，可用柱長L與t0的比值計算，即u=L/to(2)保留時間tr試樣從進樣到柱后出現峰極大點時所經過的時間，稱為保留時間(3)調整保留時間tr'a某組分的保留時間扣除死時間后，稱為

14、該組分的調整保留時間，即tr'=tr10b由于組分在色譜柱中的保留時間tr包含了組分隨流動相通過柱子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以tr實際上是組分在固定相中保留的總時間。c保留時間是色譜法定性的基本依據，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。(4)死體積Vo指色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速Fco(cm3-min-1)計算。V0=t0*Fco式中Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經溫度校正的流速。b僅

15、適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。(5)保留體積Vr指從進樣開始到被測組分在柱后出現濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：Vr=tr*Fco(6)調整保留體積Vr'某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調整保留體積。Vr'=Vr-V0=tr'*Fco(7)相對保留值r2,1某組分2的調整保留值與組分1的調整保留值之比，稱為相對保留值。r2,1=tr2'/tri'=Vr2'/Vr1'由于相對保留值只與柱溫及固定相性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性

16、的依據。2）容量因子，即分配比k分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比。即k=組分在固定相中的質量/組分在流動相中的質量=ms/mm3）分離度定義式分離度：又稱分辨率，是兩個相鄰洗脫峰之間的距離與兩個峰寬的代數平均值之比（衡量色譜分離條件優劣的參數）.“中解一二型（嶂項r可m.仁小峰寬和之半五田迎加-5）m%-5）ni+%舊用5舊尺二L0T口14=4cr=>從本J,i百討R215Tli1=6bn完全分離愴完全未分開4、色層圖中分離度有哪幾種表示方法？見課本p169分辨率表示法R=2（9R29R1）/（W1+W2）容量因子表示

17、法k'=mH選擇性表示法a=K2'/K1'柱效表示5、層析劑有那幾種？各自有何特點？疏水性吸附劑，金屬螯合層析劑，二硫鍵層析劑，凝膠，硅膠等反向介質6、何謂親和色層分離法？親和力的本質是什么？親和色層中常用的親和關系有那幾種？答：（1）利用生物分子間的這種特異性結合作用的原理進行生物物質分離純化的技術稱為親和純化技術（Affinitypurification）。親和層析是利用偶聯親和配基的親和吸附介質為固定相親和吸附目標產物，使目標產物得到分離純化的液相層析法。(2)親和力的本質：1.靜電作用：親和作用分子對的結合部位上帶有相反電荷時，產生靜電引力。在中性pH下，蛋白質

18、分子上酸性氨基酸殘基可帶負電荷，堿性氨基酸殘基可帶正電荷。此外N末端氨基酸的a-氨基帶正電，C末端氨基酸的竣基帶負電。2.氫鍵：如果親和作用分子對的一方分子中含有氧原子或氮原子，結合部位之間可以產生氫鍵作用，即形成OHO或OHNo氫鍵的產生與否受結合部位之間位置關系的嚴格制約。3.疏水性相互作用：如果親和作用分子對的一方分子上含有芳香環或爛基鏈等疏水基，另一方的結合部位上也含有疏水區，則兩者之間可發生疏水性相互作用。4.配位鍵：如果親和作用分子對均與同一金屬原子配位，則兩者之間可通過金屬配位鍵間接結合。5.弱共價鍵：弱共價鍵是指結合力較弱的可逆共價鍵。當親和作用分子對之間滿足形成弱共價鍵的條件

19、時可能形成弱共價鍵。具有親和作用的分子對之間具有“鑰匙”和“鎖孔”的空間結構關系。(3)親和色層中常用的親和體系：特異性親和作用體系高特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙-受體蛋白核酸-互補堿基鏈段、核酸結合蛋白酶-底物、產物、抑制劑群特異性免疫球蛋白-A蛋白、G蛋白酶-輔酶凝集素-糖、糖蛋白、細胞、細胞表面受體酶、蛋白質-肝素酶、蛋白質-活性色素(染料)酶、蛋白質-過度金屬離子酶、蛋白質-氨基酸(組氨酸等)7、柱層析法與固定床吸附法有何異同點？相同點：操作過程中都存在兩相，即固定相和流動相。都能對溶質分子起到分離作用。不同點：操作完成后，層析法的目標產物仍然存在于流動相中，只是由于洗出時間的不同而在

20、不同時間得到不同產物，溶質的分離程度由分辨率判斷；固定床吸附法的吸附物存在于固相中（即由液相或氣相轉移到固相），產物的分離純度取決于吸附劑的分離性質。操作方法上，柱層析是間歇操作，而固定床吸附是連續操作。在完成操作后，層析柱可以開始下一次分離，而固定床吸附法在達到穿透點之后需要停止吸附操作，轉入吸附質洗脫和吸附劑再生操作。8、色譜柱理論板數和塔板高度的計算？答：根據呈正態分布的色譜流出曲線可以導出計算塔板數n的公式，用以評7J-5.54(價一根柱子的柱效。由于色譜柱并無真正的塔板，故塔板數又稱理論塔板數:可見理論塔板數由組分保留值和峰寬決定。若柱長為L,則每塊理論塔板高度H為由上述兩式知道，理

21、論塔板數n越多、理論塔板高度H®小、色譜峰越窄，則柱效越高。但上述兩式包含死時間t0,它與組分在柱內的分配無關，因此不能真正反映色譜柱的柱效。通常以有效塔板數neff和有效塔板高度Heff表示9、常用的親和吸附介質有哪些？答：（1）酶的抑制劑酶的抑制劑有天然的生物大分子，也有小分子化合物。例如胰蛋白酶的天然蛋白質類抑制劑有胰臟蛋白酶抑制劑(pancreatictrypsininhibitor;PTI)等,小分子抑制劑有葦月米(benzamidine)、精氨酸和賴氨酸等，均可作為親和純化胰蛋白酶的配基。(2)抗體利用抗體為配基的親和色譜又稱免疫親和色譜(immuno-affinityc

22、hromatography)。抗體與抗原之間的Keq一般為1071012L/mol。因此，利用免疫親和色譜法是高度純化蛋白質類生物大分子的有效手段。(3) A蛋白proteinA為分子量約42kD的蛋白質，與IgG具有很強的親和作用，結合部位為IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5個Fc片段可結合部位。不同IgG的Fc片段的結構非常相似，因此A蛋白可作為各種抗體的親和配基，但不同抗體的結合常數有所不同。A蛋白與抗體結合并不影響抗體與抗原的結合能力，因此A蛋白也可用于分離抗原-抗體的免疫復合體。(4)凝集素凝集素(lectin)是與糖特異性結合的蛋白質(酶和抗體除外)的總稱。伴刀豆球蛋白A(c

23、oncanavalinA,conA)可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、純化。pHK5.6時conA為二聚體，分子量為52kD;pH>5.6時為四聚體，分子量為102kD,兩個亞基(subunit)之間通過二硫鍵結合。因此，在利用conA為配基的親和色譜操作中，操作條件應當適宜。(5)輔酶和磷酸腺甘脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結合作用。輔酶主要有NADnicotinamideadeninedinucleotide)、NADP(NADphosphate)和ATP(adenosinetriphosphate)等。這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。AMP(adenosine5

24、'-monophosphate)、ADP(adenosine2',5'-diphosphate)的腺昔部分與上述輔酶的結構類似，可用做這些酶的親和配基。(6)三嗪類色素利用色素為配基的親和色譜法又稱色素親和色譜(Dye-ligandaffinitychromatography)。Triazinedyes是一類分子內含有三嗪環的合成染料，與NAD的結合部位相同，又稱為生體模擬色素(biomimeticdye)。除脫氫酶和激酶外，三嗪類色素還與血清白蛋白、干擾素、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和力。(7)過渡金屬離子Cu2+,Ni2+,Zn2+和Co2將過渡金屬離子可通過與亞

25、胺二乙酸(IDA)或三竣甲基乙二胺(TED形成螯合金屬鹽固定在固定相粒子表面，用做親和吸附蛋白質的配基。這種利用金屬離子為配基的親和色譜一般稱為金屬螯合色譜(metalchelatechromatography)或固定化金屬離子親和色譜(immobilizedmetalaffinitychromato-graphy,IMAC)。(8)組氨酸組氨酸可與蛋白質發生親和結合作用：靜電和疏水性相互作用均有可能參與殺和結合。在鹽濃度較低和pH約等于目標蛋白質pI的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。(9)肝素肝素(heparin)是存在于哺乳動物的肝、肺、腸等臟器中

26、的酸性多糖類物質，分子量一般為5至30kD,具有抗凝血作用。肝素與脂蛋白、脂肪酶、番體受體、限制性核酸內切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質等具有親和作用，可用作這些物質的親和配基。肝素的親和結合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強，隨著鹽濃度的增大結合作用降低10、親和層析中目標產物的洗脫有哪幾種方法？各有何優缺點？答：特異性洗脫利用含有與親和配基或目標產物具有親和結合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合，脫附目標產物，洗脫條件溫和，有利于保護目標產物的生物活性，另外，由于僅特異性洗脫目標產物，對特異性較低的體系或非特異性吸附較嚴重的物系，特異性洗脫法有利于提高目標產物的

27、純度。非特異性洗脫是通過調節pHfi、離子強度、離子種類和溫度等理化性質降低目標產物的親和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。優點為成本低，速度快，吸附介質再生容易。缺點是洗脫體積大，目標產物在洗脫中濃度較低。如果要提高濃度或是配基與目標產物結合較強時，要選擇適當的pHfi及離子強度或加入變性劑，如果選擇不當，可能造成目標產物失活。電泳1、電泳的概念答：帶電質點在電場中向帶有異相電荷的電極遷移的現象稱為電泳。2、電泳的基本原理Vv=u=iiE答：電泳分離利用荷電溶質在電場中泳動速度的差別進行分離上3、電泳技術的分類答：有區帶電泳、等電點電泳和等速電泳。這些電泳法又根據是否使用凝膠載體分為凝膠電泳和自由流電泳。區帶電泳戟伴電泳i'I11粉末電泳抗電泳解脫電泳電泳色譜泉焦電泳II廣一淀粉電泳瓊脂需電泳黑內烯碓胺電泳導電聚拓電泳尤載體噂泳自由電泳毛細臂電泳辮度擲度電沫親知電泳4、基本的電泳系統組成電源、電極、成形盤、膠梳、膠槽、外蓋5、常規聚丙