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文檔簡介

1、12引物設計的一般原則1.引物長度引物長度 7.發卡結構發卡結構2.GC% 8.二聚體二聚體3.Tm值值 9.錯配錯配4.3端堿基要求端堿基要求 10.交叉二聚體交叉二聚體5.5端堿基要求端堿基要求 11.產物長度產物長度6.G 值值 12.評分評分3引物長度引物長度引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不應大于38。引物過短又同時會引起錯配現象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3 x 109/412=200 ).而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/4

2、00個.較長的引物（28-35bp)一般是用來區分同源性較高的模板序列或者使用于產生一些突變位點4GC% 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。5Tm值值Tm DNA溶解溫度，即DNA的雙鏈失去一半時的溫度。Tm 值計算的經驗公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 退火溫度一般低于Tm，退火溫度越高，特異性越高，但雜交率越低。PCR退火溫度一般是55，變性溫度94， Tm一般在58-70之間比較合適。兩個引物之間的Tm值應盡可能接近，不應超過463端堿基要求端堿基要求引物3端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的

3、影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3端使用堿基A。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3端出現3 個以上的連續堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發機率增加 73端堿基要求端堿基要求85端堿基要求端堿基要求 5端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。9G 值G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3端G 值較低（絕對值不超過9），而5端和中間G 值相對較高的引物。引物的3端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。（能值越高越容易結合）G高于4.5時易引發產生引物二聚體和發夾結構10發卡結構發卡結構 Hairpin 一條引物自身堿基之間發生配對一條引物自身堿基之間發生配對11二聚體二聚體 Dimer 同一條引物的兩條連之間發生堿基互補配對12錯配錯配 Fals priming 引物與模板的發生配對的位置不止一個。盡管只有某一處可以與引物完全配對吻合，但是其它位置也可與引物之間發生不完全配對，影響延伸。13交叉二聚體交叉二聚體 Cross dimer 兩條引物之間發生堿基配對14產物長度產物長度 Product

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