1、實驗一、蛋白質等電點實驗一、蛋白質等電點測定及沉淀反應測定及沉淀反應 一、實驗目的一、實驗目的1 1、了解蛋白質的兩性解離性質、了解蛋白質的兩性解離性質2 2、學習測定蛋白質等電點的一種方法、學習測定蛋白質等電點的一種方法3 3、加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識、加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識4 4、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義5 5、了解蛋白質變性與沉淀的關系、了解蛋白質變性與沉淀的關系 二、實驗原理二、實驗原理n蛋白質是蛋白質是兩性電解質兩性電解質。在蛋白質溶液中存在下。在蛋白質溶液中存在下列平衡：列平衡：n蛋白質分子的解離狀態和解離程度

2、受蛋白質分子的解離狀態和解離程度受溶液的酸溶液的酸堿度堿度影響。影響。n當溶液的當溶液的pHpH為一定值時，蛋白質極性基團解離為一定值時，蛋白質極性基團解離的正負離子數相等，凈電荷為的正負離子數相等，凈電荷為0 0，此溶液的，此溶液的pHpH值值為該為該蛋白質的等電點蛋白質的等電點。n不同蛋白質具有各自特定的等電點，與該蛋白不同蛋白質具有各自特定的等電點，與該蛋白質的組成結構有關。質的組成結構有關。n在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用性質的變化測定各種蛋白質的等電點。利用性質的變化測定各種蛋白質的等電點。n常用方法常用方法：測其溶解度最低時的溶

3、液：測其溶解度最低時的溶液pHpH值。值。問題：蛋白質等電點的測定還有哪些方法問題：蛋白質等電點的測定還有哪些方法?n本實驗通過本實驗通過觀察不同觀察不同pHpH溶液中酪蛋白的溶解溶液中酪蛋白的溶解度來測定其等電點度來測定其等電點。n用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同中）配制各種不同pHpH值的緩沖液。向各緩沖值的緩沖液。向各緩沖溶液中加入酪蛋白后，溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現最多的緩沖沉淀出現最多的緩沖液的液的pHpH值即為酪蛋白的等電點值即為酪蛋白的等電點。n在水溶液中，蛋白質分子由于表面生成在水溶液中，蛋白質分子由于表面生成水水化

4、層化層和和雙電層雙電層而成為穩定的親水膠體。而成為穩定的親水膠體。n在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因因失去電荷和脫水失去電荷和脫水而沉淀。而沉淀。n蛋白質的沉淀反應可分為兩類。蛋白質的沉淀反應可分為兩類。可逆的沉淀反應可逆的沉淀反應 l蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質而不變性。來的溶劑中，并保持其天然性質而不變性。l如：鹽析作用、低溫下用乙醇（丙酮）短時間如：鹽析作用、低溫下用乙醇（丙酮）短時間作用

5、于蛋白質。作用于蛋白質。l提純蛋白質時，常利用此類反應。提純蛋白質時，常利用此類反應。問題：提純蛋白質時常用的沉淀方法有哪些問題：提純蛋白質時常用的沉淀方法有哪些? 不可逆沉淀反應不可逆沉淀反應l蛋白質分子內部結構發生重大改變，蛋白質常蛋白質分子內部結構發生重大改變，蛋白質常變性變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。而沉淀，不再溶于原來溶劑中。l加熱加熱引起的蛋白質沉淀與凝固，蛋白質與引起的蛋白質沉淀與凝固，蛋白質與重金重金屬離子屬離子或某些或某些有機酸有機酸的反應都屬于此類。的反應都屬于此類。問題：這些不可逆的沉淀反應有哪些應用問題：這些不可逆的沉淀反應有哪些應用?l蛋白質變性后，有時由于維持溶液

6、穩定的蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。條件仍然存在（如電荷），并不析出。l因此因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而而沉淀的蛋白質也未必都已變性沉淀的蛋白質也未必都已變性。三、試劑器材三、試劑器材1 1、實驗材料、實驗材料n 雞蛋清雞蛋清n 牛奶牛奶2 2、儀器設備、儀器設備 n水浴鍋水浴鍋 n溫度計溫度計n錐形瓶錐形瓶 n100mL100mL容量瓶容量瓶n吸管吸管n試管及試管架試管及試管架 n0.4% 0.4% 酪蛋白乙酸鈉溶液：酪蛋白乙酸鈉溶液：取取20mL20mL牛奶，加入牛奶，加入10mL 1mol/L NaAC10m

7、L 1mol/L NaAC, ,用去離子水定容至用去離子水定容至100mL100mLn 1.00 mol/L 1.00 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.10 mol/L 0.10 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.01 mol/L 0.01 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液3 3、試劑、試劑n蛋白質溶液：蛋白質溶液：5%5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清（新鮮雞蛋清: :水水=1:9=1:9）n0.2M 0.2M 醋酸醋酸- -醋酸鈉緩沖液，醋酸鈉緩沖液，pH4.7 pH4.7 n3%3%硝酸銀溶液硝酸銀溶液n5%5%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液n95%95

8、%乙醇乙醇n飽和硫酸銨溶液：飽和硫酸銨溶液：2525，100mL100mL水水76.7g76.7g硫酸銨硫酸銨n0.1 M0.1 M鹽酸溶液鹽酸溶液n0.1 M0.1 M氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液n0.05 M0.05 M碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液n0.1 M0.1 M醋酸溶液醋酸溶液n甲基紅溶液：甲基紅溶液：pHpH變色范圍為變色范圍為4.4-6.24.4-6.2，由紅變黃，由紅變黃 四、實驗操作四、實驗操作（一）酪蛋白等電點的測定一）酪蛋白等電點的測定（1 1）取）取4 4支試管，按下表順序分別加入各試劑，混勻。支試管，按下表順序分別加入各試劑，混勻。試管號試管號蒸餾水蒸餾水mL0.01 M醋酸醋

9、酸mL0. 1 M醋酸醋酸mL1. 0 M醋酸醋酸mL18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6（2 2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL1mL，加一管，搖勻一管。此時加一管，搖勻一管。此時1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH依次為依次為5.95.9、5.55.5、4.74.7、3.53.5。觀察其混濁度。靜置。觀察其混濁度。靜置1010分鐘分鐘后，再觀察其混濁度。后，再觀察其混濁度。最混濁（有顆粒沉淀）的一最混濁（有顆粒沉淀）的一管管pHpH即為酪蛋白的等電點即為酪蛋白的等電點。（二）蛋白質沉淀實驗（二）蛋白質沉淀實

10、驗1. 蛋白質的鹽析蛋白質的鹽析n加加5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 mL于試管中，再加等量于試管中，再加等量飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數分鐘則析出球飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數分鐘則析出球蛋白的沉淀。蛋白的沉淀。n離心，取沉淀，加少量水，觀察是否溶解。離心，取沉淀，加少量水，觀察是否溶解。n離心后上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為離心后上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。止，此時析出的沉淀為清蛋白。n離心，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察離心，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀能否重新溶解。沉淀能否重新溶解。2. 重金屬離子沉淀蛋白質重金屬離子沉淀蛋白質n取取

11、1支試管，加入蛋白質溶液支試管，加入蛋白質溶液2 mL，再加，再加3%硝酸銀溶液硝酸銀溶液12滴，振蕩試管，有沉淀產生。滴，振蕩試管，有沉淀產生。n離心傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉離心傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？淀是否溶解？為什么？ 3有機酸沉淀蛋白質有機酸沉淀蛋白質n取取1支試管，加入蛋白質溶液支試管，加入蛋白質溶液2 mL，再加，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。生成。n離心傾去上清液，向沉淀中加入少量水，觀察離心傾去上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解沉淀是否溶解。4有機溶劑沉淀蛋白質有機

12、溶劑沉淀蛋白質n取取1支試管，加入支試管，加入2 mL蛋白質溶液，再加蛋白質溶液，再加入入2 mL 95%乙醇。混勻，觀察沉淀的生乙醇。混勻，觀察沉淀的生成。成。5乙醇引起的變性與沉淀乙醇引起的變性與沉淀 取取3支試管，編號，依下表順序加入試劑：支試管，編號，依下表順序加入試劑： 試劑試劑 mL 管號管號 5%卵卵清蛋白清蛋白0.1 M氫氧化氫氧化鈉鈉0.1 M鹽酸鹽酸pH4.7緩沖液緩沖液 95%乙乙醇醇 111121113111n振搖混勻后，觀察各管有何變化。振搖混勻后，觀察各管有何變化。n放置片刻，向各管內加水放置片刻，向各管內加水8 mL。在。在2、3號管中各加一滴甲基紅，分別用號管中

13、各加一滴甲基紅，分別用0.1 M醋醋酸酸溶液及溶液及0.05 M碳酸鈉碳酸鈉溶液中和。溶液中和。觀察顏觀察顏色的變化和沉淀的生成色的變化和沉淀的生成。n每管再加每管再加0.1 M鹽酸溶液數滴，觀察沉淀鹽酸溶液數滴，觀察沉淀的再溶解。的再溶解。n解釋各管發生的全部現象。解釋各管發生的全部現象。提示：卵清蛋提示：卵清蛋白等電點白等電點4.7n實驗結果與分析：實驗結果與分析：按照按照實驗報告實驗報告要求記錄實驗結果并分析。要求記錄實驗結果并分析。n研討：研討：通過本次實驗，有否對該項目改進的合理建議。通過本次實驗，有否對該項目改進的合理建議。 解釋鹽析、有機溶劑、等電點、重金屬、有機酸沉淀解釋鹽析、

14、有機溶劑、等電點、重金屬、有機酸沉淀蛋白質的不同機理。蛋白質的不同機理。查閱資料，介紹蛋白質等電點的測定方法。查閱資料，介紹蛋白質等電點的測定方法。查閱資料，介紹查閱資料，介紹生物大分子制備常用的沉淀方法。生物大分子制備常用的沉淀方法。蛋白質變性有哪些方面的應用？蛋白質變性有哪些方面的應用？n大組總結交流（大組總結交流（PPT）：）：內容：內容：實驗結果與分析，課后研討題，實驗體會等。實驗結果與分析，課后研討題，實驗體會等。五、實驗結果與報告五、實驗結果與報告實驗結果實驗結果管號管號pH值值混濁度混濁度 解釋現象解釋現象1234（一）酪蛋白等電點的測定（一）酪蛋白等電點的測定（二）蛋白質沉淀實驗（二）蛋白質沉淀實驗 1蛋白質的鹽析蛋白質的鹽析 現現 象象 解解 釋釋蛋白質溶液中蛋白質溶液中加硫酸銨溶液加硫酸銨溶液加水加水上清液中加硫上清液中加硫酸銨粉末酸銨粉末加水加水2重金屬離子沉淀蛋白質重金屬離子沉淀蛋白質 現現 象象解解 釋釋蛋白質溶液蛋白質溶液中