1、第二篇第二篇 色譜分析技術色譜分析技術一、色譜法的一、色譜法的起源起源、發展及定義、發展及定義一、色譜法的起源、一、色譜法的起源、發展發展及定義及定義 柱色譜柱色譜薄層色譜和紙色譜薄層色譜和紙色譜氣相色譜氣相色譜毛細管柱毛細管柱色譜色譜高效液相色譜高效液相色譜薄層掃描儀薄層掃描儀毛細管電泳毛細管電泳色譜色譜- -光譜聯用、多維色譜、智能色譜。光譜聯用、多維色譜、智能色譜。液相色譜（經典）液相色譜（經典）氣氣 質質 聯聯 用用一、色譜法的一、色譜法的起源起源、發展及、發展及定義定義二、色譜法的分類二、色譜法的分類按兩相狀態不同分類按兩相狀態不同分類按操作方法不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過

2、程的原理不同分類按色譜分離過程的原理不同分類按兩相狀態不同分類按兩相狀態不同分類 色譜其中的一相固定不動，稱為色譜其中的一相固定不動，稱為固定相固定相; ; 另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為（氣體或液體），稱為流動相流動相。兩兩 相相狀狀 態態 流動相流動相的物態的物態 液相色譜液相色譜（LCLC）氣相色譜氣相色譜（GCGC）二、色譜法的分類二、色譜法的分類按兩相狀態不同分類按兩相狀態不同分類按操作方法不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過程的原理不同分類按色譜分離過程的原理不同分類按操作方法不同分類按操作方法不同分類柱色譜柱

3、色譜紙色譜紙色譜薄層色譜薄層色譜二、色譜法的分類二、色譜法的分類按兩相狀態不同分類按兩相狀態不同分類按操作方法不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過程的原理不同分類按色譜分離過程的原理不同分類按色譜分離過程的原理不同分類按色譜分離過程的原理不同分類（1 1）吸附色譜）吸附色譜（2 2）分配色譜）分配色譜（3 3）離子交換色譜）離子交換色譜（4 4）分子排阻色譜（凝膠色譜法）分子排阻色譜（凝膠色譜法) )色譜法色譜法GCGCLCLCCECE填充柱色譜法填充柱色譜法毛細管柱色譜法毛細管柱色譜法柱色譜柱色譜平面色譜法平面色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法經典液相色譜法經典液相色譜法吸附柱色譜吸附柱色

4、譜分配柱色譜分配柱色譜離子交換色譜離子交換色譜凝膠色譜凝膠色譜薄層色譜法薄層色譜法紙色譜紙色譜毛細管電泳色譜法毛細管電泳色譜法三、色譜過程三、色譜過程四、色譜曲線相關術語四、色譜曲線相關術語W：峰寬：峰寬Wh/2：半峰寬：半峰寬tR：保留時間：保留時間t0：死時間：死時間tR，：調整保留時間：調整保留時間色譜峰色譜峰基線基線第七章第七章 薄層色譜法薄層色譜法 薄層色譜是在平面上進行分離的一種方法，又叫薄層色譜是在平面上進行分離的一種方法，又叫平平面色譜法面色譜法。通常將固定相。通常將固定相( (吸附劑吸附劑) )均勻地涂鋪在表面潔均勻地涂鋪在表面潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成凈的玻璃、

5、塑料或金屬板形成薄層，制成薄板薄板，進行樣品分離。，進行樣品分離。特點：快速特點：快速 靈敏（用量小）靈敏（用量小） 高選擇性（如同分異構體）高選擇性（如同分異構體） 簡便簡便 顯色方便顯色方便 應用廣泛：化合物的鑒別和少量化合物的分離應用廣泛：化合物的鑒別和少量化合物的分離 用于檢測藥品含量用于檢測藥品含量 藥物合成中用于鑒別反應程度和監控反應歷程藥物合成中用于鑒別反應程度和監控反應歷程 用于摸索高效液相的色譜條件用于摸索高效液相的色譜條件( (一一) )吸附色譜分離原理吸附色譜分離原理利用利用吸附劑吸附劑對不同成分對不同成分吸附力的大小吸附力的大小及及展開劑解吸展開劑解吸附附作用的差異作用

6、的差異進行分離。進行分離。吸附牢的組分隨展開劑移動慢，吸附弱的組分隨展開吸附牢的組分隨展開劑移動慢，吸附弱的組分隨展開劑移動快，一段時后，組分被分離。劑移動快，一段時后，組分被分離。固定相固定相: :固體固體吸附劑吸附劑流動相流動相: :液體展開劑液體展開劑一、基本原理一、基本原理第一節第一節 薄層色譜法的基本原理薄層色譜法的基本原理溶劑溶劑前沿前沿起始線起始線ABabc（1 1）比移值）比移值R Rf f：原原點點到到溶溶劑劑前前沿沿的的距距離離原原點點到到斑斑點點中中心心的的距距離離 fRcbRcaR)b(f)a(f R Rf f是薄層色譜法基本是薄層色譜法基本定性定性參數，一定條件時參數

7、，一定條件時R Rf f為為定值，在定值，在0 01 1之間，可用范圍之間，可用范圍R Rf f值在值在0.20.20.80.8之之間。組分極性越大，間。組分極性越大，R Rf f越小越小, ,反之越大反之越大。（二）比移值與相對比移值（二）比移值與相對比移值（2 2）相對比移值）相對比移值R Rs s：為消除系統誤差為消除系統誤差的距離原點到對照品斑點中心心的距離原點到樣品組分斑點中sRR Rf f1,1,R Rs s不一定小于不一定小于1 1。（二）比移值與相對比移值（二）比移值與相對比移值二、吸附薄層色譜中吸附劑與展開劑二、吸附薄層色譜中吸附劑與展開劑常用的吸附劑：常用的吸附劑：硅膠、氧

8、化鋁、聚酰胺、活性炭和大孔吸硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭和大孔吸附樹脂附樹脂等。等。吸附劑的選擇要合適，與流動相、被分離化合吸附劑的選擇要合適，與流動相、被分離化合物不反應物不反應（一）吸附劑（固定相）的選擇（一）吸附劑（固定相）的選擇（1 1）硅膠：極性吸附劑，應用范圍廣）硅膠：極性吸附劑，應用范圍廣 物理吸附為主，氫鍵吸附為輔物理吸附為主，氫鍵吸附為輔 微酸性，不直接用于堿性成分的分離微酸性，不直接用于堿性成分的分離 機械強度好，適用于薄層色譜機械強度好，適用于薄層色譜 吸附容量大，與羥基數目有關吸附容量大，與羥基數目有關常用硅膠的規格：硅膠常用硅膠的規格：硅膠H H，硅膠，硅膠G G，硅

9、膠，硅膠GFGF254254等等 （2 2）氧化鋁：）氧化鋁：a.a.極性吸附劑，較硅膠強。極性吸附劑，較硅膠強。 b.b.物理吸附為主，氫鍵吸附為輔物理吸附為主，氫鍵吸附為輔 c.c.微堿性，不直接用于酸類成分的分離微堿性，不直接用于酸類成分的分離堿性氧化鋁堿性氧化鋁：適用于：適用于碳氫化合物、生物碳氫化合物、生物 堿以及其它堿性堿以及其它堿性化合物的分離。化合物的分離。中性氧化鋁中性氧化鋁：應用最廣，適用于：應用最廣，適用于醛、酮、醛、酮、 醌以及酯類醌以及酯類化合物的分離。化合物的分離。 酸性氧化鋁：酸性氧化鋁：適用于適用于有機酸類有機酸類的分離。的分離。 硅膠和氧化鋁硅膠和氧化鋁含水量

10、越高，吸附活性越弱。含水量越高，吸附活性越弱。 只要在只要在110110左右加熱，這些左右加熱，這些“自由水自由水” ” 就能被可逆性就能被可逆性地除去。地除去。利用這一原理可以對吸附劑進行利用這一原理可以對吸附劑進行活化活化（去水）和（去水）和脫脫活化活化（加水）處理，以控制吸附劑的活性。（加水）處理，以控制吸附劑的活性。 硅膠、氧化鋁的含水量與活性級別硅膠、氧化鋁的含水量與活性級別活性等級IIIIIIIVV 氧化鋁加水量 /%0361015 硅膠加水量 /%0515 2538硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質極性越大，越易被吸附。極性越大，越易被吸附。一般規律：一般規

11、律：（1）官能團極性越大官能團極性越大，整個分子極性越大，越易被吸附；整個分子極性越大，越易被吸附；（2）形成分子內）形成分子內H鍵時，被吸附力減弱；鍵時，被吸附力減弱；（3）同系物中，）同系物中，分子量越大，極性越小分子量越大，極性越小，被吸附力越弱。被吸附力越弱。常見官能團極性順序：常見官能團極性順序： 烷烴烷烴烯烴烯烴醚類醚類硝基化合物硝基化合物酯類酯類酮類酮類 醛類醛類硫醇硫醇胺類胺類醇類醇類酚類酚類羧酸類羧酸類被分離物質極性與吸附能力的關系被分離物質極性與吸附能力的關系（二）展開劑（流動相）的選擇（二）展開劑（流動相）的選擇 硅膠、氧化鋁薄層硅膠、氧化鋁薄層：展開劑的極性越大，其展開

12、能力越強，：展開劑的極性越大，其展開能力越強，化合物在色譜中移動的速度就越快，表現為化合物在色譜中移動的速度就越快，表現為Rf 增大。增大。常用溶劑極性大小常用溶劑極性大小選擇原則：選擇原則：被分離成分極性大展開劑極性大被分離成分極性大展開劑極性大被分離成分極性小展開劑極性小被分離成分極性小展開劑極性小吸附劑、展開劑選擇規律吸附劑、展開劑選擇規律考慮三方面因素：被分離組分極性，吸附劑活性、洗脫劑極性。考慮三方面因素：被分離組分極性，吸附劑活性、洗脫劑極性。活潑活潑不活潑不活潑吸附劑吸附劑（固定相）（固定相）展開劑展開劑（流動相）（流動相）被分離物質被分離物質BBACC極性極性非極性非極性非極性

13、非極性極性極性A硅膠薄層色譜規律總結硅膠薄層色譜規律總結被分離組分被分離組分極性極性展開劑展開劑極性極性吸附劑吸附劑活性活性R Rf f被分離物被分離物洗脫順序洗脫順序大大弱小后洗脫小小強大先洗脫第二節 薄層色譜系統簡介第三節 操作方法及注意事項略：在操作方法中部分介紹一、儀器的性能檢定二、背景干擾的消除三、樣品測定操作方法1 1、薄層板的制備、薄層板的制備 2 2、點樣、點樣3 3、展開、展開 4 4、顯色和定位、顯色和定位5 5、薄層掃描儀對斑點掃描、薄層掃描儀對斑點掃描1、薄層板的制備、薄層板的制備要求：玻璃板需光潔，否則吸附劑易脫落；要求：玻璃板需光潔，否則吸附劑易脫落； 大小由需求決

14、定。大小由需求決定。薄層板分類和制法軟板的制備軟板的制備硬板的制備硬板的制備 傾注法傾注法 平鋪法平鋪法 機械涂布法機械涂布法1、薄層板的制備、薄層板的制備（1 1）軟板的制備）軟板的制備軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑3.3.橡皮膏橡皮膏 4.4.橡皮管橡皮管要求：厚度要求：厚度隨分離要求而定，一般隨分離要求而定，一般0.250.250.5mm0.5mm 玻璃棒推動速度不宜過快、也不應停頓玻璃棒推動速度不宜過快、也不應停頓影響厚度均一性影響厚度均一性優點：方法簡便、隨用隨鋪、展開速度快。優點：方法簡便、隨用隨鋪、展開速度快。缺點：吸

15、附劑易脫落、只能用近水平展開，效果差。缺點：吸附劑易脫落、只能用近水平展開，效果差。薄層板分類和制法軟板的制備軟板的制備硬板的制備硬板的制備 傾注法傾注法 平鋪法平鋪法 機械涂布法機械涂布法1、薄層板的制備、薄層板的制備（2 2）硬板的制備）硬板的制備硬板：吸附劑加粘合劑制成的板硬板：吸附劑加粘合劑制成的板常用的粘合劑：煅石膏（）常用的粘合劑：煅石膏（） 機械強度差，易脫落，但不易腐蝕機械強度差，易脫落，但不易腐蝕羧甲基纖維素鈉（羧甲基纖維素鈉（CMC-NaCMC-Na） 機械強度好，不易脫落，但易腐蝕且機械強度好，不易脫落，但易腐蝕且 a a、傾注法：、傾注法：硅膠硅膠G G或氧化鋁或氧化鋁

16、G G，直接加水調成糊狀，直接加水調成糊狀硅膠或氧化鋁，加羧甲基纖維素鈉水溶液調成糊狀硅膠或氧化鋁，加羧甲基纖維素鈉水溶液調成糊狀倒在玻璃板上倒在玻璃板上均勻鋪開、振蕩、晾干、活化、置干燥器中備用。均勻鋪開、振蕩、晾干、活化、置干燥器中備用。（2 2）硬板的制備）硬板的制備 b b、平鋪法：、平鋪法：1. 1. 吸附劑薄層吸附劑薄層 2. 2. 涂布器涂布器 3. 3. 玻璃夾板玻璃夾板4. 4. 玻璃板玻璃板 5. 5. 玻璃夾板玻璃夾板過程：制板過程：制板振蕩振蕩晾干晾干活化活化備用備用優點：一次鋪多塊薄層板，簡單易行。優點：一次鋪多塊薄層板，簡單易行。（2 2）硬板的制備）硬板的制備 c

17、 c、機械涂布法：、機械涂布法：優點：簡單方便、薄板厚度均勻、分離效果好。優點：簡單方便、薄板厚度均勻、分離效果好。 手動涂布器手動涂布器 全自動涂布器全自動涂布器常用的薄層板：常用的薄層板：軟板：硅膠軟板：硅膠H H板、氧化鋁板、氧化鋁H H板板硬板：常用的有硅膠硬板：常用的有硅膠G G板、氧化鋁板、氧化鋁G G板、硅膠板、硅膠CMC-NaCMC-Na板、氧板、氧化鋁化鋁CMC-NaCMC-Na板、硅膠板、硅膠GF GF 、硅膠、硅膠GFGF2、點樣、點樣（1 1）樣品溶液的制備：）樣品溶液的制備： 怎樣選擇溶劑？怎樣選擇溶劑？ 水可以用嗎？水可以用嗎？2、點樣、點樣（2 2）點樣量：）點樣

18、量： 與薄層板的關系與薄層板的關系 太多太少的影響太多太少的影響點樣基線：距底邊點樣基線：距底邊2.0cm2.0cm樣點直徑：樣點直徑：2-4mm2-4mm點間距離：點間距離：1.5-2.0cm1.5-2.0cm2、點樣、點樣（3 3）點樣方法：）點樣方法： 劃線、樣品記號點、點樣劃線、樣品記號點、點樣 注：動作要輕，注：動作要輕， 毛細管或點樣器不能混用，毛細管或點樣器不能混用， 斑點大小適當，可多次點樣。斑點大小適當，可多次點樣。平頭平頭50ul50ul微量點樣器微量點樣器全自動點樣儀全自動點樣儀3、展開、展開展開缸（色譜缸）展開缸（色譜缸）3、展開、展開（1 1）展開方式：）展開方式：a

19、 a、近水平展開、近水平展開特點：速度快、適用于軟板的展開。特點：速度快、適用于軟板的展開。3、展開、展開（1 1）展開方式：）展開方式：b b、上行展開、上行展開 過程：預飽和（濾紙貼于展開槽內側）、展開、標記過程：預飽和（濾紙貼于展開槽內側）、展開、標記溶劑前沿溶劑前沿c c、單向二次展開、單向二次展開d d、雙向二次展開、雙向二次展開3、展開、展開（1 1）展開方式：）展開方式：萜的各類含萜的各類含氧衍生物氧衍生物極性較小的展開劑極性較小的展開劑極性較大的展開劑極性較大的展開劑原點：含氧衍生物原點：含氧衍生物萜烯類萜烯類含氧衍生物含氧衍生物3、展開、展開（2 2）注意事項：）注意事項：a

20、 a、色譜槽需密閉良好、色譜槽需密閉良好脂溶性展開劑：甘油淀粉糊脂溶性展開劑：甘油淀粉糊水溶性展開劑：凡士林水溶性展開劑：凡士林b b、注意防止邊緣效應、注意防止邊緣效應4、顯色和定位、顯色和定位一般規律：一般規律：日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法紫外燈觀察紫外燈觀察噴顯色劑觀察噴顯色劑觀察5、薄層掃描儀對色譜斑點進行掃描、薄層掃描儀對色譜斑點進行掃描 用一束長寬可以調節的一定波長、一定強度的光照射到薄層斑點上進行整個斑點的掃描，用儀器測量通過斑點或被斑點反射的光束強度的變化從而達到定量

21、的目的。 判斷依據：判斷依據：R Rf f值、值、R Rs s值值1、查找資料：影響Rf值的因素 吸附劑種類、活度、顆粒大小；展開劑純度和極性；薄層厚度；點樣量；展開方式、溫濕度；展開槽中的預飽和狀態等。2、對照品比較法：常用。四、結果計算和判斷四、結果計算和判斷（一）定性鑒別（一）定性鑒別1、對照品比較法：、對照品比較法：雜質對照品制成一定濃度的溶液雜質對照品制成一定濃度的溶液樣品制成一定濃度溶液樣品制成一定濃度溶液按相同的點樣量點樣按相同的點樣量點樣展開后觀察斑點顏色深淺和大小展開后觀察斑點顏色深淺和大小（二）雜質檢查（雜質限量檢查）（二）雜質檢查（雜質限量檢查）如異煙肼中游離肼的檢查：

22、肼是一種誘變劑和致癌物質，中國藥典對異煙肼原料和注射用異煙肼中游離肼的檢查均采用薄層色譜法。 檢查方法取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作為供試品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相當于游離肼50g）的溶液，作為對照溶液。吸取供試液10l 與對照溶液2l，分別點于同一硅膠薄層板（用羧甲基纖維素鈉溶液制備）上，以異丙醇丙酮（3:2）為展開劑，展開后，晾干，噴以乙醇制對二甲氨基苯甲醛試液，15min后檢視，在供試品主斑點前方與硫酸肼斑點相應的位置上，不得顯黃色斑點。 2、自身稀釋對比法、自身稀釋對比法（雜質結構不明或無雜質對照品）（雜質結構不明或無雜質對照品）樣品溶液稀釋

23、制成一定濃度的溶液樣品溶液稀釋制成一定濃度的溶液樣品制成一定濃度溶液樣品制成一定濃度溶液按相同的點樣量點樣按相同的點樣量點樣展開后觀察斑點顏色深淺和大小展開后觀察斑點顏色深淺和大小（二）雜質檢查（雜質限量檢查）（二）雜質檢查（雜質限量檢查）如地西泮中有關物質的檢查： 取本品的細粉適量（約相當于地西泮200mg），加丙酮5ml,振搖，使地西泮溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液；精密量取適量，加丙酮稀釋成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作為對照溶液。點樣展開后，供試品溶液如顯雜質斑點，與對照溶液的主斑點比較，不得更深。 1、目視比較法：、目視比較法：對照品制成不同濃度的系列溶液對照品制成不同濃

24、度的系列溶液樣品制成定量溶液樣品制成定量溶液按相同的點樣量點樣按相同的點樣量點樣展開后觀察斑點顏色深淺和大小展開后觀察斑點顏色深淺和大小注：本法適用于近似含量的測定，誤差注：本法適用于近似含量的測定，誤差10%10%（三）含量測定（三）含量測定2、斑點洗脫法、斑點洗脫法對照品制成溶液對照品制成溶液 點于薄板兩側點于薄板兩側樣品制成一定濃度溶液樣品制成一定濃度溶液 線狀點于薄板起始線中間部分線狀點于薄板起始線中間部分展開展開對對照品顯色，以此為依對對照品顯色，以此為依據刮下含有樣品的吸附劑據刮下含有樣品的吸附劑將樣品溶解，按照分光光度法測定溶液濃度將樣品溶解，按照分光光度法測定溶液濃度（三）含量

25、測定（三）含量測定3、薄層掃描法、薄層掃描法（三）含量測定（三）含量測定（1）外標法 用待測組分的純品作對照物質，以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為及等。工作曲線法是用對照物質配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，工作曲線法也可以用代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法定量。 此法要求點樣量準確相同。此法要求點樣量準確相同。 取本品水蜜丸取本品水蜜丸6g6g，研碎，或取小蜜丸或大蜜丸

26、，研碎，或取小蜜丸或大蜜丸9g9g，切，切碎，加硅藻土碎，加硅藻土4g4g，研勻。加乙醚，研勻。加乙醚40ml40ml，低溫回流，低溫回流1 1小時，濾小時，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加丙酮過，濾液揮去乙醚，殘渣加丙酮1ml1ml使溶解，作為供試品溶使溶解，作為供試品溶液。另取液。另取丹皮酚丹皮酚對照品，加丙酮制成每對照品，加丙酮制成每1ml1ml含含1mg1mg的溶液，的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法作為對照品溶液。照薄層色譜法( (附錄附錄 B) B)試驗，吸取上試驗，吸取上述兩種溶液各述兩種溶液各10l,10l,分別點于同一硅膠薄層板上，以環分別點于同一硅膠薄層板上，以環己烷醋酸乙酯己烷醋酸乙酯(3:1) (3:1) 為展開劑，展開，取出，晾干，噴為展開劑，展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸性以鹽酸酸性 5 5三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍褐色斑點。藍褐色斑點。 （20052005年版年版中國藥典中國藥典一部一部 4014