1、PCR常見問題及解決方案PCR常見問題及解決方案PCR技術簡介技術簡介PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案提高提高PCR反應特異性的策略反應特異性的策略主講內容主講內容PCR技術簡介技術簡介 DNA模板模板 引物引物 反應緩沖液反應緩沖液 dNTP ddH2O 耐熱聚合酶耐熱聚合酶反應體系對反應體系對PCRPCR擴增的影響擴增的影響DNA模板模板純度純度 蛋白、多糖、酚類等雜質會抑制蛋白、多糖、酚類等雜質會抑制PCRPCR反應反應完整性完整性 模板降解會導致模板降解會導致PCRPCR擴增無產物擴增無產物濃度濃度 加量過多導致非特異性擴增增加加量過多導致非特異性擴增

2、增加特異性特異性 長度適當長度適當、避免二級結構和二聚體避免二級結構和二聚體完整性完整性 避免反復凍融避免反復凍融濃度濃度 應適當應適當, ,過高導致非特異性增加過高導致非特異性增加, ,過低則過低則引引 物物擴增產物太少擴增產物太少反應體系對反應體系對PCRPCR擴增的影響擴增的影響反應反應 pH值值, ,鹽離子濃度鹽離子濃度穩定劑穩定劑, ,增強劑增強劑Mg 2濃度濃度過高非特異性嚴重過高非特異性嚴重過低無擴增產物過低無擴增產物濃度適當濃度適當避免反復凍融避免反復凍融ddH2OpH值適當值適當避免污染避免污染 DNA模板模板 引物引物 反應緩沖液反應緩沖液 Mg 2 dNTP ddH2O

3、耐熱聚合酶耐熱聚合酶如何選擇如何選擇的的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性 PCR 實驗的不同需求實驗的不同需求如何選擇如何選擇的的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性純純 度度穩定性穩定性酶活性酶活性如何選擇如何選擇的的DNA聚合酶聚合酶 PCR 實驗的不同需求實驗的不同需求長片段擴增長片段擴增PCR試劑盒試劑盒 擴增效率擴增效率 保保 真真 性性 特特 異異 性性 基因組擴增、RT-PCR 基因篩選、測序、 基因克隆 復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）構建基因圖譜、測序、分子遺傳學 復雜模板擴增、大規模基因檢測特異性特異性 熱啟動熱啟動 Taq酶酶原原

4、理理 蠟封蠟封 抗體抑制抗體抑制 化學修飾化學修飾特特 點點 避免非特異性擴增避免非特異性擴增 提高提高PCR反應的反應的特異性特異性用用 途途 基因組擴增基因組擴增 RT-PCR 熱啟動熱啟動 Taq酶酶特異性特異性產產 品品 類類 型型產產 品品 名名 稱稱產產 品品 性性 能能化學修飾化學修飾 天為時代天為時代: HotStart Taq Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start DNA Polymerase Stratagene: SureStart Taq 大大提高大大提高PCRPCR反應的特異性反應的特異性 化學修飾不影化學修飾不影響后續

5、實驗響后續實驗抗體抑制抗體抑制 Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum Taq TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 蠟封蠟封 Promega：TaqBeadTM HotStart 保真性保真性 高保真酶高保真酶原原 理理用用 途途 35核酸核酸 表達基因的克隆表達基因的克隆基因的定點突變基因的定點突變 細胞內基因點突變細胞內基因點突變分析分析（SNPSNP） 外切酶活性外切酶活性 降低堿基錯配率降低堿基錯配率 保真性保真性 高保真酶高保真酶產產 品品 類類 型型生生 物物 公公 司司性性 能能 比比 較較PfuDNA Polyme

6、rase 天為時代天為時代 Stratagene Promega在目前已發現的所有在目前已發現的所有耐熱聚合酶中耐熱聚合酶中, Pfu, Pfu保保真度最高堿基錯配率真度最高堿基錯配率最低最低PyrobestTM DNA Polymerase TaKaRaTli DNA PolymerasePromega 高保真高保真 高擴增效率高擴增效率原原 理理 混合酶混合酶高擴增效率高擴增效率 35核酸外切核酸外切用用 途途 超長片段擴增超長片段擴增 測序測序 構建基因圖譜構建基因圖譜 復雜模板擴增復雜模板擴增GC含量高含量高二級結構二級結構 高保真高保真 高擴增效率高擴增效率特特 點點 產產 品品性性

7、 能能高擴增效率高擴增效率天為時代天為時代：Taq Plus TaKaRa：Ex TaqTM 復雜模板擴增復雜模板擴增高保真高保真天為時代天為時代： Taq Platinum Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity 保真度低于保真度低于PfuPfu聚合酶聚合酶但擴增效率較高但擴增效率較高 長片段擴增長片段擴增天為時代天為時代：Long Taq TaKaRa：LA Taq Invitrogen：Elongase Amplificaiton System 特別適用于保真度較特別適用于保真度較高的高的 超長片段擴增超長片段擴增PCR MasterMix原原

8、 理理預配好的預配好的PCR反應液反應液 DNA聚合酶聚合酶 反應緩沖液反應緩沖液 dNTPdNTP PCR增強劑增強劑 PCR Master Mix特特 點點 快速簡便快速簡便 減少加樣誤差和污染減少加樣誤差和污染 靈敏度高靈敏度高 可擴增低至可擴增低至2 2個拷貝的目的模板個拷貝的目的模板 特異性強特異性強 降低降低PCRPCR反應的要求，反應的要求，增強特異性增強特異性 穩定性好穩定性好 長期放置活性無改變長期放置活性無改變適用范圍適用范圍 大規模基因檢測大規模基因檢測 目的基因拷貝數極低的樣本目的基因拷貝數極低的樣本 GC含量高含量高, ,有二級結構的模板有二級結構的模板 復雜基因組樣

9、本復雜基因組樣本 可直接檢測菌落，基因點突變檢測可直接檢測菌落，基因點突變檢測, , 或者陽性克隆的篩選。或者陽性克隆的篩選。PCR技術簡介技術簡介PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案提高提高PCR反應特異性的策略反應特異性的策略PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案 無擴增產物 非特異性擴增 拖尾 假陽性無擴增產物模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer對樣品不合適對樣品不合適引物設計不當或者發生降解引物設計不當或者發生降解反應條件：反應條件：退火溫度太高，延伸時間退火溫度太高，延伸時間太短太短 原因

10、原因對對策策純化模板或者使用試劑盒提取模板純化模板或者使用試劑盒提取模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更換更換BufferBuffer或調整濃度或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間降低退火溫度、延長延伸時間現象：正對照有條帶，而樣品則無正對照有條帶，而樣品則無； 非特異性擴增 現象：現象：PCRPCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。者同時出現特異性擴增帶與非特

11、異性擴增帶。引物特異性差引物特異性差模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高酶量過多酶量過多MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高退火溫度偏低退火溫度偏低循環次數過多循環次數過多 原因原因對對策策重新設計引物或者使用巢式重新設計引物或者使用巢式PCRPCR適當降低模板或引物濃度適當降低模板或引物濃度適當減少酶量適當減少酶量降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用適當提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法減少循環次數減少循環次數 非特異性擴增 拖尾 現象：現象：產物在凝膠上呈產物在凝膠上呈Smear狀態狀態。 NoImage M 1 2模板不純模板不純BufferBuffer不合適不合適退火

12、溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環次數過多循環次數過多 原因原因對對策策純化模板純化模板更換更換BufferBuffer適當提高退火溫度適當提高退火溫度適量用酶適量用酶適當降低適當降低dNTPdNTP和和鎂離子鎂離子的濃的濃度度減少循環次數減少循環次數 拖尾 假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況（篩選轉基因、檢測基因表達情況) ) 原因：靶序列或擴增產物的交叉污染靶序列或擴增產物的交叉污染 現象：空白對照出現目的擴增產物空白對照出現目的擴增產物 對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；操作時應小心輕柔，防止將靶序列

13、吸入加樣槍內或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 PCR技術簡介技術簡介PCR常見問題、原因分析及其解決方案常見問題、原因分析及其解決方案提高提高PCR反應特異性的策略反應特異性的策略提高提高PCR反應特異性的策略反應特異性的策略巢式巢式PCR（Nest-PCR） 遞減遞減PCR（TouchDown PCR） 熱啟動熱啟動PCR（HotStart PCR）

14、使用使用PCR增強劑增強劑巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。補的靶序列很少。 巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的靈敏度，并且的靈敏度，并且提高了困難提高了困難PCR（如如5 RACE）的特異性。）的特異性。 遞減遞減PCR（TouchDown PCR） 遞減遞減PCR通過在通過在PCR的前幾個循環使用嚴謹的退火條件提高特異的前幾個循環使用嚴謹的退火條件提高特異性。循環設在比估算的性。循環設在比估算的TmTm高大約高大約5的退火溫度下開始，然后每個循環的退火溫度下開始，然后每個循環降低降低1 1-2 2, ,直到退火溫度低于直到退火溫度低于Tm Tm 5。 特異性最高的目的模板會被優先擴增，這些產物在隨后的循環特異性最高的目的模板會被優先擴增，這些產物在隨后的循環中繼續擴增占據優勢。中繼續擴增占據優勢。 遞減遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如如AFLP、DNA指紋分析等。指紋分析等。熱啟動熱啟動PCR （HotSta