1、12現代生物技術現代生物技術基因工程技術基因工程技術 細胞工程技術細胞工程技術 酶工程技術酶工程技術 發酵工程技術發酵工程技術 細胞培養細胞培養3細胞分離技術細胞分離技術l 從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞l 從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞l 從原培養容器中分離細胞從原培養容器中分離細胞 - - 傳代培養傳代培養原代培養原代培養4細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞采血方法：采血方法：l 人人 靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血；靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血；l 小動物（大鼠、小鼠）小動物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心臟穿刺法、剪尾法、眼

2、眶采血、心臟穿刺法、斷頸取血或股動脈放血。斷頸取血或股動脈放血。l 兔兔 耳靜脈或動脈穿刺取血。耳靜脈或動脈穿刺取血。 5細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞血液抗凝方法：血液抗凝方法：l 肝素法肝素法：按每：按每mlml血液約用血液約用0.1-0.2mg0.1-0.2mg肝素（即肝素（即5%5%肝素溶液肝素溶液2-42-4l l）；）；l 草酸鹽法：草酸鹽法：取草酸鉀取草酸鉀0.2g0.2g，草酸銨，草酸銨0.3g0.3g，加雙蒸水，加雙蒸水10ml10ml溶解后，取溶解后，取0.2ml0.2ml放入放入5ml5ml的試管中，使其干燥。若采用的試管中，使其干

3、燥。若采用5ml5ml以下的血液可直接注以下的血液可直接注入此試管中，輕輕搖晃；入此試管中，輕輕搖晃；l 枸櫞酸鈉法：枸櫞酸鈉法：先配制先配制2%2%枸櫞酸鈉，取枸櫞酸鈉，取0.15-0.2ml0.15-0.2ml加于加于1ml1ml血液中即可血液中即可抗凝；抗凝；l EDTAEDTA法法（186.1186.1）：每）：每mlml血液中加血液中加0.5mmol/L EDTA 20.5mmol/L EDTA 2l l。6細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞體液標本采集：體液標本采集： 在局部在局部70%70%酒精消毒滅菌后，用滅菌注射器穿刺入體腔酒精消毒滅菌后，

4、用滅菌注射器穿刺入體腔（如胸腔，腹腔，關節腔等）抽取液體樣品。（如胸腔，腹腔，關節腔等）抽取液體樣品。 膝關節腔穿刺膝關節腔穿刺 胸腔穿刺胸腔穿刺 7細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞血樣中紅細胞和白細胞的分離：血樣中紅細胞和白細胞的分離： 利用細胞的相對密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉利用細胞的相對密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法結合不同速度的離心沉降法將不同的細胞分離。降法結合不同速度的離心沉降法將不同的細胞分離。 抗凝血，室溫或抗凝血，室溫或3737下直立靜置下直立靜置30-60min30-60min，紅細胞沉降至下層，中，

5、紅細胞沉降至下層，中間乳白色薄膜層為白細胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血間乳白色薄膜層為白細胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血與與3%3%明膠（經滅菌消毒）等量或明膠（經滅菌消毒）等量或3 3l l量混合于離心管中，直立靜置量混合于離心管中，直立靜置30-30-60min60min，紅細胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細胞。，紅細胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細胞。 8細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞血中單個核細胞的分離：血中單個核細胞的分離： 單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其相對密度在單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其相對密度在

6、1.050-1.0771.050-1.077之間，采用速度沉降法原理使其分離。之間，采用速度沉降法原理使其分離。 淋巴細胞分離液淋巴細胞分離液9細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞血中單核細胞的分離：血中單核細胞的分離： 利用細胞在培養過程中貼壁時間的早晚不同進行細胞分離利用細胞在培養過程中貼壁時間的早晚不同進行細胞分離單單個個核核細細胞胞懸懸液液多將懸液放入多將懸液放入12cm12cm直徑的培養直徑的培養皿中，于皿中，于3737培養箱中靜置培養箱中靜置30-30-60min60min。此時單核細胞貼壁，而。此時單核細胞貼壁，而淋巴細胞尚未貼壁，傾出未貼淋巴細

7、胞尚未貼壁，傾出未貼壁細胞，并用壁細胞，并用HanksHanks液輕輕沖洗液輕輕沖洗培養皿以盡量洗下培養皿以盡量洗下未貼壁細胞未貼壁細胞（淋巴細胞）。（淋巴細胞）。 用用Hanks液強液強力沖洗吹打與力沖洗吹打與震蕩，將貼壁震蕩，將貼壁的單核細胞沖的單核細胞沖落或用刮刀輕落或用刮刀輕刮，收集刮，收集貼壁貼壁的單核細胞的單核細胞。 計數后計數后分別制分別制備所需備所需濃度的濃度的細胞懸細胞懸液。液。10細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞黏附法分離血中單核細胞、黏附法分離血中單核細胞、T T，B B淋巴細胞淋巴細胞 因因B B淋巴細胞和單核細胞能黏附于淋巴細胞和

8、單核細胞能黏附于尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），所以可將其與所以可將其與T T淋巴細胞分離。淋巴細胞分離。11具體步驟：具體步驟：l 單個核細胞用含單個核細胞用含20%20%小牛血清小牛血清RPMI-1640RPMI-1640制成（制成（2.5-32.5-3）10107 7/ml/ml的細的細胞懸液。胞懸液。l 先用先用HanksHanks液，再用含液，再用含20%20%小牛血清的小牛血清的RPMI-1640RPMI-1640液沖洗平衡尼龍纖維液沖洗平衡尼龍纖維柱，沖洗液盡量流凈。柱，沖洗液盡量流凈。l 將尼龍柱預溫將尼龍柱預溫3737，再用配制的單個核細胞懸液，再

9、用配制的單個核細胞懸液2ml2ml裝入尼龍纖維柱，裝入尼龍纖維柱，不使流出，不使流出，3737溫箱內靜置溫箱內靜置l l小時。小時。l 取下注射針頭，用預溫取下注射針頭，用預溫3737含含20%20%小牛血清的小牛血清的RPM I-1640RPM I-1640培養液沖洗培養液沖洗尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的T T淋巴細胞。淋巴細胞。l 從注射器內取出尼龍纖維，在從注射器內取出尼龍纖維，在44的的RPMI-1640RPMI-1640液內漂洗，并輕輕擠壓，液內漂洗，并輕輕擠壓，將黏附的將黏附的B B細胞洗脫收集（細胞洗脫收集（B B淋巴細胞中混有的單核細胞可用貼壁法

10、將淋巴細胞中混有的單核細胞可用貼壁法將其分離）。其分離）。l 收集的收集的T T、B B淋巴細胞可分別用淋巴細胞可分別用HanksHanks液懸浮，洗滌，離心（液懸浮，洗滌，離心（250g250g，7min7min），并重復洗滌），并重復洗滌3 3次。計算活細胞，計數懸液中的細胞數后制備次。計算活細胞，計數懸液中的細胞數后制備所需濃度的所需濃度的T T和和B B淋巴細胞懸液。淋巴細胞懸液。12細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)(MACS)分離分離T T、B B淋巴細胞：淋巴細胞： 磁性微珠是磁性微珠是2020世紀世紀8080年

11、代初以高分子材料和金屬離子（如年代初以高分子材料和金屬離子（如FeFe3 3O O4 4）為原料聚合而成的一種以為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心金屬離子為核心、外層均勻地包裹、外層均勻地包裹高分子聚合高分子聚合體體的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場的吸引作用，磁性的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對某種細胞表面抗原的微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對某種細胞表面抗原的特異性抗體特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。即可制成免疫磁性微珠。 13細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細

12、胞 免疫磁性微珠免疫磁性微珠用于細胞的分離和純化用于細胞的分離和純化的基本原理及步驟是：首先將抗的基本原理及步驟是：首先將抗特異細胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細胞反應特異細胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細胞反應后，利用磁力的作用，使與致敏結合的細胞與其它物質分離，達到純化、后，利用磁力的作用，使與致敏結合的細胞與其它物質分離，達到純化、分離的目的。分離的目的。 通常有二種分離方式：通常有二種分離方式：陽性分離陽性分離和和陰性分離陰性分離。陽性分離是直接從細胞。陽性分離是直接從細胞混合液中分離出靶細胞，陰性分離是利用磁珠去除無關細胞，使靶細胞混合液中分離出靶

13、細胞，陰性分離是利用磁珠去除無關細胞，使靶細胞得以分離。得以分離。14細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞 免疫磁珠分離細胞已被廣泛應用于人類各種細胞的分離，如免疫磁珠分離細胞已被廣泛應用于人類各種細胞的分離，如T(CD3)、B(CD19)淋巴細胞、內皮細胞淋巴細胞、內皮細胞(CD34)、造血祖細胞、造血祖細胞(CD34)、單核、單核/巨噬細巨噬細胞胞(CD14)、胰島細胞、胰島細胞(胰島胰島GK和和GLUT2（葡萄糖轉運子）（葡萄糖轉運子）) 、多種腫瘤、多種腫瘤細胞等。細胞等。15細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞16細

14、胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞17細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞18細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞MACS技術優點技術優點：l 穩定、高質量的分選穩定、高質量的分選：純度（：純度（90-99%）l 對細胞無損傷對細胞無損傷l 操作簡便、快速：操作簡便、快速：消毒方便，手動分選消毒方便，手動分選30分鐘內分鐘內完成，完成，autoMACS分選分選2.5-10分鐘之內完成。分鐘之內完成。l 從實驗室到臨床：從實驗室到臨床：MACS技術可以實現技術可以實現105-1011個個細胞分選

15、。有細胞分選。有autoMACS和和CliniMACS。l 分選后細胞適用于后續實驗：分選后細胞適用于后續實驗：分選后適用于細胞分選后適用于細胞培養和體內實驗，分選得到的標記和未標記細胞培養和體內實驗，分選得到的標記和未標記細胞組分均可回收利用。組分均可回收利用。l 從細胞到分子分選：從細胞到分子分選：不僅可以分選各種細胞，還不僅可以分選各種細胞，還可以分選轉染細胞、亞細胞物質、蛋白質、可以分選轉染細胞、亞細胞物質、蛋白質、DNA、RNA及及mRNA。MACS技術缺點：技術缺點：l分離效率較分離效率較流式細胞儀流式細胞儀分分選略低選略低l且耗材相對較貴，適合無且耗材相對較貴，適合無大型大型流式

16、細胞儀流式細胞儀設備且對分設備且對分選細胞純度要求不高的分選。選細胞純度要求不高的分選。l只適用于簡單標記的細胞只適用于簡單標記的細胞分離分離19細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞流式細胞術分離法分離流式細胞術分離法分離T、B淋巴細胞：淋巴細胞：l 密度梯度離心法分離單個核細胞，用密度梯度離心法分離單個核細胞，用RPMI-1640培養基配成培養基配成1107 /ml；l 加適量加適量FITC-抗抗CD3或或FITC-抗抗CD19，4孵育孵育30min, 用用RPMI-1640培養基洗培養基洗2次；次；l 用流式細胞儀進行分析。在散射光參數圖上選取淋巴細胞群，

17、在熒光用流式細胞儀進行分析。在散射光參數圖上選取淋巴細胞群，在熒光參數圖上選取綠色熒光陽性的細胞進行分選。參數圖上選取綠色熒光陽性的細胞進行分選。20細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞注意事項：注意事項：l 分選細胞常用于細胞亞群進一步的功能研究，因此，整個過程均需要分選細胞常用于細胞亞群進一步的功能研究，因此，整個過程均需要嚴格無菌操作，流式細胞儀進行無菌沖洗。嚴格無菌操作，流式細胞儀進行無菌沖洗。l 此法分離得到的此法分離得到的T細胞純度可達到細胞純度可達到99%,收獲率可達到收獲率可達到90%。l 由于噴嘴孔很?。s由于噴嘴孔很?。s70100m），分

18、選前用），分選前用3040m孔徑的濾網孔徑的濾網過濾細胞懸液，以免堵塞噴嘴。過濾細胞懸液，以免堵塞噴嘴。21細胞分離技術細胞分離技術-從血液、體液中分離細胞從血液、體液中分離細胞優缺點：優缺點：l流式細胞儀分選純度較高、回收率高，分選一些具有比較復雜細胞標流式細胞儀分選純度較高、回收率高，分選一些具有比較復雜細胞標記的細胞時相當有用的，例如要分選出白血病人骨髓中某些記的細胞時相當有用的，例如要分選出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚細胞，只需要在流式上簡單地邏輯設門就的幼稚細胞，只需要在流式上簡單地邏輯設門就可以了，而且流式可以雙通道分選，也就是同一時間分選出兩種細胞

19、，可以了，而且流式可以雙通道分選，也就是同一時間分選出兩種細胞，流式分選成本比磁珠低。流式分選成本比磁珠低。l流式分選最致命的缺點就是污染，且設備昂貴，技術復雜，需專業技流式分選最致命的缺點就是污染，且設備昂貴，技術復雜，需專業技術人員操作，操作費時，適合對細胞純度和回收率要求較高的分選。術人員操作，操作費時，適合對細胞純度和回收率要求較高的分選。22細胞分離技術細胞分離技術二、從原代組織中分離細胞二、從原代組織中分離細胞組織和器官采集：組織和器官采集：l人標本：人標本：可采取無菌手術法切取少量所需的組織或器官（活檢和手術）?？刹扇o菌手術法切取少量所需的組織或器官（活檢和手術）。l大量的動物

20、組織：大量的動物組織：先麻醉或處死，浸入先麻醉或處死，浸入70%70%酒精中，使毛皮全部浸濕，從腹酒精中，使毛皮全部浸濕，從腹中線剪開皮膚，注意不要剪開胸腔或腹腔。將皮膚向上、下撕開分離并向上、下中線剪開皮膚，注意不要剪開胸腔或腹腔。將皮膚向上、下撕開分離并向上、下翻開，暴露胸腹部的筋膜，用生理鹽水洗凈黏于筋膜上的斷毛，以碘酒和翻開，暴露胸腹部的筋膜，用生理鹽水洗凈黏于筋膜上的斷毛，以碘酒和70%70%酒酒精消毒后，更換一套消毒滅菌的器械，剪開胸腔或腹腔，無菌采取所需器官。精消毒后，更換一套消毒滅菌的器械，剪開胸腔或腹腔，無菌采取所需器官。l動物的骨髓：動物的骨髓：可以無菌手術采取一段股骨，用

21、滅菌注射器，將小牛血清或培可以無菌手術采取一段股骨，用滅菌注射器，將小牛血清或培養液從斷端一端加壓注射以從另一斷端出骨髓。養液從斷端一端加壓注射以從另一斷端出骨髓。23細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞制備細胞懸液方法：制備細胞懸液方法：l 將組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，最常用的將組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，最常用的是是機械解離細胞法、酶學解離細胞法機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及以及螯合劑解離細胞螯合劑解離細胞法法。l 從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚酶解聚。細胞。細胞暴露在酶中的時間

22、要盡可能的短，以保持最大的活性。包暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持最大的活性。包括括胰蛋白酶、膠原酶胰蛋白酶、膠原酶和和中性蛋白酶中性蛋白酶等。等。24細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞1.1.胰蛋白酶胰蛋白酶 ( (Trypsin) ) 在去除不需要的組織后，使用無鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，在去除不需要的組織后，使用無鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，重復清洗重復清洗2到到3次。用無菌的解剖刀和剪子把組織切成次。用無菌的解剖刀和剪子把組織切成1-2mm3小塊。小塊。將盛有組織碎片的容器置于冰上。加入將盛有組織碎片的容器置于冰上。加入0.25溶解在無鈣鎂的溶解在

23、無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入組織加入1ml 胰蛋白酶）。胰蛋白酶）。25細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞 在在4孵育孵育6到到18小時，使胰蛋白酶盡可能滲透進小時，使胰蛋白酶盡可能滲透進去去移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含殘留孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片胰蛋白酶的組織碎片20到到30分鐘分鐘 在組織碎片加入熱的完全培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使在組織碎片加入熱的完全培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑用無血清培養基，要加入大豆胰

24、蛋白酶抑制劑 通過無菌不銹鋼絲網（通過無菌不銹鋼絲網（100-200目）過濾，計數和接種細胞，進行培目）過濾，計數和接種細胞，進行培養養 26細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞2. 2. 膠原酶膠原酶 (Collagenase(Collagenase) ) 用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成1-2mm3小塊，用小塊，用Hanks平衡液平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次）清洗組織碎片幾次 加入膠原酶（加入膠原酶（50200單位單位/ml，溶解在，溶解在HBSS中）中） 在在37孵育孵育4到到18小時。加入小時。加入3mM CaCl2增

25、加解離效率增加解離效率 27細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞通過離心在通過離心在HBSS中清洗懸液幾次中清洗懸液幾次 再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養 通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，分離分散細胞、組織碎通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如需進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶片和較大的碎片。如需進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶 28細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞3.3.中性蛋白酶中性蛋白酶(Disp

26、ase(Dispase) )用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成1-2mm3小塊，用不含鈣鎂的平衡小塊，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次鹽溶液清洗組織碎片幾次 加入加入Dispase（0.62.4單位單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液） 在在37孵育孵育20分鐘到幾個小時。分鐘到幾個小時。 29細胞分離技術細胞分離技術通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，分離分散細胞、組織碎通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如需進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的片和較大的碎片。如需進一步的解聚，在碎片中加入

27、新鮮的Dispase 通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次 再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養 30細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞舉例（滑膜細胞的膠原酶胰蛋白酶消化分離法舉例（滑膜細胞的膠原酶胰蛋白酶消化分離法 ）: :無菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等無菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等 用用D-Hanks液（無液（無Ca2+、Mg2+，含青霉素，含青霉素200kUL-1、鏈霉素、鏈霉素200mgL-1）反復沖洗后剪成）反復沖洗后剪成12mm3小塊，離心洗滌小塊，離

28、心洗滌2 次次置于加入置于加入2ml含含10%胎牛血清、胎牛血清、0.4%型膠原酶的型膠原酶的DMEM培養液的培培養液的培養瓶中，在養瓶中，在37、5%CO2培養箱中消化培養箱中消化2h，每隔，每隔10min吹打吹打1 次。次。 31細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞再加入含再加入含0.25%胰蛋白酶的胰蛋白酶的D-Hanks液液4ml，培養消化，培養消化30min 將培養液移至離心管中，將培養液移至離心管中，1200rpm離心離心10min，棄上清，棄上清 200目尼龍網紗過濾，目尼龍網紗過濾，1200 rpm離心離心10min，棄上清，棄上清 將獲得的細胞在

29、將獲得的細胞在37、5%CO2培養箱中培養培養箱中培養24h，棄去未黏附細胞，棄去未黏附細胞（如淋巴細胞，紅細胞），此時的貼壁細胞即為原代滑膜細胞（如淋巴細胞，紅細胞），此時的貼壁細胞即為原代滑膜細胞 32細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞4.4.組織塊培養法組織塊培養法舉例（成纖維樣滑膜細胞組織塊培養法）：舉例（成纖維樣滑膜細胞組織塊培養法）：無菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等，用不含鈣鎂的無菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等，用不含鈣鎂的D-Hanks液（含液（含青霉素青霉素200kUL-1、鏈霉素、鏈霉素200mgL-1）反復沖洗后剪成）反復沖洗后剪成12mm3

30、小塊小塊 用吸管吸取均勻排列于培養瓶（預先用含用吸管吸取均勻排列于培養瓶（預先用含20胎牛血清胎牛血清DMEM培養液培養液濕潤）的底壁，瓶底朝上，濕潤）的底壁，瓶底朝上，37、5%CO2培養箱中培養培養箱中培養3h，使其貼壁，使其貼壁 33細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞待細胞快長滿時用待細胞快長滿時用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代培養，胰蛋白酶消化細胞并傳代培養，取第取第35代細胞用于實驗代細胞用于實驗觀察到有大量成纖維細胞長出后輕輕去除組織塊，繼續培養觀察到有大量成纖維細胞長出后輕輕去除組織塊，繼續培養輕輕翻轉培養瓶，輕輕翻轉培養瓶，使培養液剛剛覆蓋組織

31、塊，每隔使培養液剛剛覆蓋組織塊，每隔23天換一次培養液天換一次培養液34成纖維樣滑膜細胞組織塊培養法成纖維樣滑膜細胞組織塊培養法培養培養24h培養培養96h培養培養120h35細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞舉例（初步淋巴細胞分離法）：舉例（初步淋巴細胞分離法）：放血處死動物，無菌取胸腺和脾組織，去除脂肪和結締組織，放入盛放血處死動物，無菌取胸腺和脾組織，去除脂肪和結締組織，放入盛有含有含5%小牛血清的小牛血清的D-Hanks液（不含鈣鎂，含青霉素液（不含鈣鎂，含青霉素200kUL-1、鏈、鏈霉素霉素200mgL-1）平皿的網紗中（）平皿的網紗中（200目）目

32、）用注射器針芯輕輕碾碎胸腺和脾組織，使單個細胞經網進入溶液中用注射器針芯輕輕碾碎胸腺和脾組織，使單個細胞經網進入溶液中溶液移入離心管中，溶液移入離心管中， 1200 rpm離心離心10min，棄上清，棄上清， D-Hanks液洗滌液洗滌細胞，加入細胞，加入DMEM培養液計數和調節細胞濃度，進行培養培養液計數和調節細胞濃度，進行培養 36細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞舉例（乳鼠原代心肌細胞培養法）：舉例（乳鼠原代心肌細胞培養法）：基本原理基本原理： 心肌細胞培養方法有心肌細胞培養方法有離體心臟灌注法離體心臟灌注法、酶消化法酶消化法和和組織塊法組織塊法，將心，將

33、心肌組織分離成單個細胞，用培養基制成心肌細胞懸液，在體外適宜條件肌組織分離成單個細胞，用培養基制成心肌細胞懸液，在體外適宜條件下使之生長繁殖，并保留其結構與功能特性。下使之生長繁殖，并保留其結構與功能特性。37細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞評價評價：l 離體心臟灌注法對乳大鼠來說實施難度大離體心臟灌注法對乳大鼠來說實施難度大;l 酶消化法操作流程長，細胞對消化酶濃度及作用時間要求嚴格，但是酶消化法操作流程長，細胞對消化酶濃度及作用時間要求嚴格，但是能得到大量單細胞；能得到大量單細胞；l 組織塊法操作簡單，實驗成本低，可得到具較高純度的心肌細胞。組織塊法操作簡

34、單，實驗成本低，可得到具較高純度的心肌細胞。因此，心肌細胞原代培養常用的方法多用酶消化法和組織塊法兩種。因此，心肌細胞原代培養常用的方法多用酶消化法和組織塊法兩種。38細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞心肌細胞的酶消化培養法：心肌細胞的酶消化培養法：1.心肌組織的選擇：心肌組織的選擇： 生后生后14天的天的Wistar乳鼠心臟等。乳鼠心臟等。2.心肌組織塊的制備：心肌組織塊的制備： 乳鼠用乳鼠用75%乙醇乙醇/1%新潔爾滅消毒皮膚，新潔爾滅消毒皮膚，無菌開胸無菌開胸，暴露心臟暴露心臟，于，于心臟收縮期剪下心臟，置于盛心臟收縮期剪下心臟，置于盛D-Hanks 液的

35、培養皿中，剪開心臟，清洗液的培養皿中，剪開心臟，清洗三次，以去除血污。三次，以去除血污。39細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞3.心肌細胞懸液的制備：心肌細胞懸液的制備： 取心尖部組織（心室）剪為取心尖部組織（心室）剪為1mm3碎塊，在大離心管中放入組織碎塊，碎塊，在大離心管中放入組織碎塊，加入加入0.06% 0.25%的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶溶液815ml，在磁力攪拌器上，在磁力攪拌器上，37水浴水浴消化消化10min，自然沉淀后棄上清。剩余組織塊中再加入新胰蛋白酶，自然沉淀后棄上清。剩余組織塊中再加入新胰蛋白酶， 消消化化10min，靜置后將上清液移入盛有，

36、靜置后將上清液移入盛有15%新生牛血清培養液的離心管中新生牛血清培養液的離心管中終止消化，并以終止消化，并以1000rpm離心離心10min，棄上清，用培養液充分吹打成單細，棄上清，用培養液充分吹打成單細胞懸液。剩余沉淀用同樣條件及方法反復消化，直至將組織基本完全消胞懸液。剩余沉淀用同樣條件及方法反復消化，直至將組織基本完全消化為止，分次收獲心肌細胞?；癁橹?，分次收獲心肌細胞。40細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織中分離細胞4.心肌細胞懸液的接種：心肌細胞懸液的接種： 將分次收獲的心肌細胞用將分次收獲的心肌細胞用Hanks 液離心清洗液離心清洗12 次，棄上清液。將次，棄

37、上清液。將沉淀細胞定量加入培養基沉淀細胞定量加入培養基35 mL，吹打混勻，制成細胞懸液。應用白細，吹打混勻，制成細胞懸液。應用白細胞計數板計數細胞，調整至所需濃度，胞計數板計數細胞，調整至所需濃度，37 、5 % CO2 培養箱培養。培養箱培養。5.細胞純化：細胞純化： 培養培養2 h，將細胞懸液進行換瓶培養，去除瓶底的貼壁細胞；，將細胞懸液進行換瓶培養，去除瓶底的貼壁細胞；2 h 后，后，去除瓶底的貼壁細胞，重復一次，方法同前，以去除成纖維細胞，純化去除瓶底的貼壁細胞，重復一次，方法同前，以去除成纖維細胞，純化心肌細胞。心肌細胞。41細胞分離技術細胞分離技術-從原代組織中分離細胞從原代組織

38、中分離細胞心肌細胞的貼塊培養法：心肌細胞的貼塊培養法： 1.取材：取材：按前述方法取出心臟，置于盛按前述方法取出心臟，置于盛Hanks 液的培養皿中，清液的培養皿中，清洗三次。洗三次。 2.貼塊：貼塊：將心臟剪為將心臟剪為1mm3大小的小塊，移入培養瓶底面，用無菌大小的小塊，移入培養瓶底面，用無菌牙科探針將其均勻鋪開。牙科探針將其均勻鋪開。 3.干固：干固：蓋上瓶蓋，蓋上瓶蓋，37 烤箱培養瓶翻轉干固烤箱培養瓶翻轉干固11.5 h。 4.接種培養：接種培養：添加少量培養基，以恰好蓋住組織塊為佳，次日加添加少量培養基，以恰好蓋住組織塊為佳，次日加足培養液。足培養液。4243細胞分離技術細胞分離技

39、術三、從原培養容器中分離細胞（傳代培養）三、從原培養容器中分離細胞（傳代培養） 貼壁細胞在培養瓶長成致密單層后，繼續生長的空間不貼壁細胞在培養瓶長成致密單層后，繼續生長的空間不足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養，對細胞進行傳代擴增。多堆積，需要分瓶培養，對細胞進行傳代擴增。44細胞分離技術細胞分離技術-傳代培養傳代培養l 對于貼壁不太緊的細胞如人胚胎腎（對于貼壁不太緊的細胞如人胚胎腎（HEK）293細胞等，可以直接吹細胞等，可以直接吹散后分瓶散后分瓶;l 對于貼壁較緊的細胞如中華倉鼠卵巢（對于貼壁較緊的細

40、胞如中華倉鼠卵巢（CHO）細胞、滑膜細胞）細胞、滑膜細胞（Synoviocytes）等，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按）等，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按無菌操作的要求進行）：無菌操作的要求進行）： 45細胞分離技術細胞分離技術-傳代培養傳代培養將長成致密單層細胞的細胞瓶中原來的培養液棄去將長成致密單層細胞的細胞瓶中原來的培養液棄去 加入加入0.25胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使或更多，以使充分浸潤充分浸潤一般消化時間約為一般消化時間約為1-3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細胞層，當見到分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細

41、胞層，當見到出現細針孔空隙時，棄去胰酶溶液，并加入適量的細胞培養液終止消出現細針孔空隙時，棄去胰酶溶液，并加入適量的細胞培養液終止消化化 ，也可以在顯微鏡下觀察細胞是否變圓，也可以在顯微鏡下觀察細胞是否變圓視實驗要求分入多瓶繼續培養，一般為一傳二到一傳四的比例視實驗要求分入多瓶繼續培養，一般為一傳二到一傳四的比例 46細胞分離技術細胞分離技術-傳代培養傳代培養胰酶消化的程度是一個關鍵：胰酶消化的程度是一個關鍵： 消化過度則對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，消化過度則對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反隨棄去的胰酶流失；消化不足則細胞

42、難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。復吹打同樣也會損傷細胞活性。47細胞分離技術細胞分離技術-傳代培養傳代培養影響消化速度的因素：影響消化速度的因素： 主要有主要有胰酶溶液的活性胰酶溶液的活性（配制條件、（配制條件、凍存或凍存或4保存時保存時間長短、是否反復凍融、化凍后存放時間及溫間長短、是否反復凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加所加胰酶溶液的多少胰酶溶液的多少等。消化程度以輕吹或加培養液后輕搖可下等。消化程度以輕吹或加培養液后輕搖可下為好。下面將細胞生長及不同消化程度

43、的光學顯微鏡照片列為好。下面將細胞生長及不同消化程度的光學顯微鏡照片列出以供參考（以出以供參考（以CHO細胞為例）。細胞為例）。48復蘇后細胞復蘇后細胞培養培養24h培養培養48h剛加胰酶剛加胰酶開始皺縮開始皺縮明顯皺縮明顯皺縮基本變圓基本變圓完全變圓完全變圓49細胞培養技術細胞培養技術l 細胞培養的基本概念細胞培養的基本概念l 體內、外細胞的差異和分化體內、外細胞的差異和分化l 細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程l 細胞培養的無菌環境細胞培養的無菌環境l 常用培養器皿及清洗消毒常用培養器皿及清洗消毒l 培養物的污染及防止培養物的污染及防止l 細胞培養常用營養液和試劑的配制細胞培養常用營養液

44、和試劑的配制l 細胞庫細胞庫50細胞培養技術細胞培養技術一、細胞培養的基本概念一、細胞培養的基本概念 體外培養體外培養（in vitro culture），就是將活體結構成分或），就是將活體結構成分或活的個體從體內或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環活的個體從體內或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環境的體外環境中，讓其生長和發育的方法。境的體外環境中，讓其生長和發育的方法。 51細胞培養技術細胞培養技術-基本概念基本概念l 組織培養組織培養：是指從生物體內取出活的組織（多指組織塊）：是指從生物體內取出活的組織（多指組織塊）在體外進行培養的方法。在體外進行培養的方法。 l 細胞培養細胞培養：

45、是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進：是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養的方法。行培養的方法。 l 器官培養器官培養：是指從生物體內取出的器官（一般是胚胎器：是指從生物體內取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養的方官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養的方法。法。 52細胞培養技術細胞培養技術-體內、外細胞的差異和分化體內、外細胞的差異和分化 二、體內、外細胞的差異和分化二、體內、外細胞的差異和分化 差異：差異： 細胞離體后，失去了細胞離體后，失去了神經體液的調節神經體液的調節和和細胞間的相互影響細胞間的相互影響，生活在，生活在缺乏動態平衡相對穩

46、定環境中，日久天長，易發生如下變化：缺乏動態平衡相對穩定環境中，日久天長，易發生如下變化：l分化現象減弱；分化現象減弱；l形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；l發生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。發生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。 因此，培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們因此，培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被

47、置于體外培養后，這種差異就開始發生了。的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后，這種差異就開始發生了。53細胞培養技術細胞培養技術分化：分化： 體外培養的細胞體外培養的細胞分化能力分化能力并未完全喪失，只是環境的改變，細胞分并未完全喪失，只是環境的改變，細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化, ,關鍵在于是否存在使細胞分關鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如化的條件，如FriendFriend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養時能長成血以合成血紅蛋

48、白，血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養時能長成血管狀結構，雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化管狀結構，雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為。行為。54細胞培養技術細胞培養技術三、細胞培養的一般過程三、細胞培養的一般過程 準備工作：準備工作： 準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，準備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。內容包重視，準備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。內容包括括器皿的清洗、干燥與消毒、培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌、器皿的清洗、干

49、燥與消毒、培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌、無菌室或超凈臺的清潔與消毒、培養箱及其他儀器的檢查與調試無菌室或超凈臺的清潔與消毒、培養箱及其他儀器的檢查與調試。 55細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程 取材：取材： 在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過程一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取

50、出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。細胞的首次培養稱為原代培養。 56細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程 理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上幼幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。 取材后應取材后應立即處理，盡快培養立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成

51、黃豆般大的小塊，置切成黃豆般大的小塊，置44的培養液中保存。取組織時應嚴格的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。57細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程培養：培養： 將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊組織塊培養，則直接將組

52、織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。箱中，使細胞盡早進入生長狀態。 58細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程 正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括正在培養中的細胞應

53、每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PHPH是否太酸或太堿是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度培養溫度和和COCO2 2濃度濃度也要定時檢查。也要定時檢查。 原代培養一般有一段原代培養一般有一段潛伏期潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。長期。 59細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過

54、程細胞培養的一般過程 細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（不死性（ImmortalityImmortality）而無惡性。）而無惡性。 60細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程l 細胞系（細胞系（Ce

55、ll LineCell Line）：）：原代培養物經首次傳代成功即成細胞系，由原代培養物經首次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系（原先存在于原代培養物中的細胞世系（Lineage of CellsLineage of Cells）所組成。）所組成。如細胞系的生存期有限，則稱之為如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（有限細胞系（Finite Cell LineFinite Cell Line）；）；已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，稱已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，稱連續細胞系或無限細胞系連續細胞系或無限細胞系（Infinite Cell LineInfinite

56、Cell Line）。）。 l 細胞株（細胞株（Cell StrainCell Strain）：）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得細胞系中獲得具有特殊性質或標志物具有特殊性質或標志物的稱為細胞株。細胞株的特殊性的稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。質或標志必須在整個培養期間始終存在。6162細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程每代貼附生長細胞的生長過程：每代貼附生長細胞的生長過程： 游離期游離期 貼壁期貼壁期 潛伏期潛伏期 對數生長期對數生長期 停止期（平臺期）停止期（平臺期）63細胞培養

57、技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程凍存及復蘇凍存及復蘇: : 為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存，這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?，F簡要介紹凍存，這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深深低溫保存法低溫保存法(-70-196)的特點。的特點。64細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程細胞深低溫保存的基本原理：細胞深低溫保存的基本原理： 在在-70以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于完

58、全停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過020階段的階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。65細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程細胞深低溫保存的基本方法：細胞深低溫保存的基本方法： 將細胞收集至凍存管中加入含將細胞收集至凍存管中加入含保護劑保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的（一般為二甲亞砜或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低

59、的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入出凍存管后，立即放入37水中，使之在水中，使之在一分鐘內一分鐘內迅速融解。然后將細迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。胞轉入培養器皿中進行培養。 66細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程懸浮細胞的保存懸浮細胞的保存: : 計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200400g離心離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪分鐘沉淀細胞

60、，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞；亂細胞； 以以1107到到5107細胞細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基（密度，在包含有血清的冷凍培養基（DMSO終濃度為終濃度為5-10%）中再次懸浮細胞，或者以）中再次懸浮細胞，或者以0.5107到到1107在無血在無血清冷凍培養基中，再次懸浮細胞；清冷凍培養基中，再次懸浮細胞； 分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4冰箱中，冰箱中，5分鐘內開始分鐘內開始冷凍步驟；冷凍步驟；67細胞培養技術細胞培養技術-細胞培養的一般過程細胞培養的一般過程l 傳統方法：傳統方法：l 程序降溫：可以通過可編程序的冷凍