1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 堿變性法小量制備質(zhì)粒堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘耙粚?shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘皐質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。w大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。w其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于宿主編碼的蛋白和酶。質(zhì)粒特點(diǎn)w質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命。w質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體， 是細(xì)菌有性繁殖的性因子.w年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。質(zhì)粒類(lèi)型w質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類(lèi)型： 松弛型質(zhì)粒 和 嚴(yán)緊型質(zhì)粒w1.松弛型質(zhì)粒

2、松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴(lài)于宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒w嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個(gè)質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過(guò)用氯霉素等蛋白合成抑制劑來(lái)增加。質(zhì)粒的應(yīng)用w大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。w嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。w質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膚本實(shí)驗(yàn)要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。分

3、離質(zhì)粒DNA方法w從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的w堿變性法；w煮沸法；wSDS法；w 羥基磷灰石層析法等w各方法分離是依據(jù)宿主菌株類(lèi)型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。堿變性法基本原理w在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。w將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、

4、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑w培養(yǎng)基：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5NaCl 10gw： 0.1M NaCl10mM Tris HCl(pH8.0)1mM EDTAw 50mg/mlw溶菌酶 10mg/ml (用10mM TrisHCl pH8.0新鮮配制）試劑w溶液： 50mM 葡萄糖25mM TrisHCl（pH8.0）10mM EDTAw溶液：（新鮮配制）0.2N NaOH1% SDSw溶液： 5M KAC 10ml冰醋酸 11.5ml水 28.5mlw酚，氯仿，乙醇 RNase 瓊脂糖w

5、： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTApUC18鏈長(zhǎng)鏈長(zhǎng)2,686 bp pUC18是適合于雙脫氧法DNA測(cè)序的載體，在lacZ領(lǐng)域中含有多克隆位點(diǎn)，因此在含有IPTG， X-Gal的平板培養(yǎng)基上，很容易判斷有無(wú)外源基因的插入。此外，也可以利用lac promoter表達(dá)外源基因。進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，可以很方便地使用M13系列Primers。w多克隆位點(diǎn)：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I 和Hind III 只有一個(gè)酶切位點(diǎn)。 w用途用途w克隆外源基因。 w利用lac promo

6、ter進(jìn)行基因表達(dá)。 w使用M13 primers進(jìn)行DNA測(cè)序。 wpUC18/pUC19 cloning site圖圖 w 三實(shí)驗(yàn)方法三實(shí)驗(yàn)方法w挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5ml LB培養(yǎng)液中（含AmP 50g/ml）， 強(qiáng)烈搖蕩過(guò)度。w取1.5ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清，用ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀。w將細(xì)菌沉淀懸浮于100l預(yù)冷溶液中，振蕩混勻，冰上放置5分鐘。w加入200l溶液，蓋嚴(yán)管蓋輕柔顛倒次以混勻內(nèi)容物，冰上放置5分鐘。w加入150l溶液，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置分鐘。w12000g 4 離心分鐘，取上

7、清移到個(gè)新的Eppendorf管中。 w(加入等體積酚/氯仿（：），振蕩混勻，12000g 4 離心分鐘。取上清移至另個(gè)Eppendorf管中。)w加入倍體積無(wú)水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。w g ,4 離心分鐘。w棄上清，加入ml 70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴(yán)管蓋顛倒數(shù)次，000g 于4 離心分鐘。w棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。w加入50l TE（含20g/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。 13取10l DNA溶解液用稀釋至1000ul測(cè)定OD260和OD280,計(jì)算OD260/OD2 80之比；14. 同時(shí)以以下公式計(jì)算得率。質(zhì)粒DNA得率：稀釋倍數(shù)OD2600.0550/1.5ml15取10l DNA溶解液加2l Loading buffer于1%瓊脂糖,電泳3小時(shí),電壓40伏。16電泳凝膠在透射式紫外檢測(cè)儀上觀察，記錄結(jié)果。四結(jié)果分析四結(jié)果分析w質(zhì)粒DNA OD260,OD280的值，由此計(jì)算質(zhì)粒DNA得率和純度。w記錄