1、實驗五實驗五 1.1.酶聯免疫吸附試驗（酶聯免疫吸附試驗（ELISA)ELISA)2.2.補體結合反應補體結合反應1.1.酶聯免疫吸附試驗（酶聯免疫吸附試驗（ELISA)ELISA)免疫標記技術免疫標記技術定義：定義： 將抗原將抗原- -抗體反應與標記技術相結合，用抗體反應與標記技術相結合，用放射放射性同位素、酶或熒光素性同位素、酶或熒光素標記的已知抗體或抗原，通標記的已知抗體或抗原，通過檢測標記物，間接測定未知的抗原或抗體。過檢測標記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類：分類： 放射免疫測定法：放射免疫測定法：131131I I，3232P P 免疫熒光技術：免疫熒光技術：FITCFITC，P

2、EPE 免疫酶測定法：免疫酶測定法：HRPHRP，APAP免疫酶測定法免疫酶測定法酶聯免疫吸附試驗酶聯免疫吸附試驗用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）中未知抗體或抗原的方法。中未知抗體或抗原的方法。將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗檢測液相中未知抗體檢測液相中未知抗體將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗檢測液相中的可溶性抗原檢測液相中的可溶性抗原將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或抗體抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體檢測液

3、相中的可溶性抗原或抗體酶聯免疫吸附試驗酶聯免疫吸附試驗（以間接性（以間接性ELISAELISA為例）為例）：實驗內容：實驗內容： 間接法測定溶血素間接法測定溶血素 定性檢測定性檢測實驗材料實驗材料脫纖維綿羊紅細胞脫纖維綿羊紅細胞 抗原抗原兔抗綿羊紅細胞抗體（溶血素）兔抗綿羊紅細胞抗體（溶血素） 待測兔血清待測兔血清HRPHRP標記羊抗兔標記羊抗兔IgG IgG 二抗二抗包被緩沖液：包被緩沖液：0.05M pH9.60.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液洗滌液：含洗滌液：含0.05% Tween 200.05% Tween 20的的0.01M pH7.4 PBS0.01M pH7.4 P

4、BS底物緩沖液：底物緩沖液： pH5.0pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：底物溶液：OPD 10mgOPD 10mg，底物緩沖液，底物緩沖液25ml25ml，30% H30% H2 2O O2 2 40L 40L酶標板，酶標儀酶標板，酶標儀實驗方法實驗方法1.1.抗原的處理：抗原的處理：2.2.包被抗原：包被抗原：取出包被好抗原的酶標板（取出包被好抗原的酶標板（4 4孔孔/ /組），甩干孔內液體組），甩干孔內液體以洗滌液（以洗滌液（200L/200L/孔）洗滌孔）洗滌3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待測血清加待測血清標記各孔，加入相應液體標記各孔，加入相應

5、液體100L/100L/孔孔1234陰陰性性空空白白陽陽性性待待測測4.4.加二抗：加二抗：3737，濕盒內，濕盒內，30min30min甩干孔內液體甩干孔內液體以洗滌液（以洗滌液（200L/200L/孔）洗滌孔）洗滌3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶標二抗各孔加入酶標二抗100L/100L/孔孔3737，濕盒內，濕盒內，30min30min5.5.顯色：顯色：甩干孔內液體甩干孔內液體以洗滌液（以洗滌液（200L/200L/孔）洗滌孔）洗滌3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光顯色，避光顯色，10min10min6.6.觀察結果

6、觀察結果實驗方法實驗方法 陽性：顯色為黃色陽性：顯色為黃色 陰性：無色陰性：無色1 2 3 4陰性陰性陰性陰性 陽性陽性陽性陽性注意事項注意事項 洗滌徹底，避免交叉污染。洗滌徹底，避免交叉污染。 按順序加樣，孔底無氣泡。按順序加樣，孔底無氣泡。 包被和溫育在濕盒內進行。包被和溫育在濕盒內進行。2.2.補體結合反應補體結合反應（Complement fixation Test, CFTComplement fixation Test, CFT）概念：概念： 補體結合反應：補體結合反應： 是指在是指在補體補體的參與下，以綿羊紅細胞的參與下，以綿羊紅細胞（SRBCSRBC）和溶血素（抗）和溶血素（抗

7、SRBCSRBC的抗體）作為的抗體）作為指指示系統示系統的的抗原抗體反應抗原抗體反應。補反中包括補反中包括兩個系統兩個系統五種成分：五種成分： 待檢系統：已知待檢系統：已知AgAg或或AbAb、待檢、待檢AbAb或或AgAg及及僅供一組僅供一組Ag-AbAg-Ab系統反應的定量補體。系統反應的定量補體。 指示系統：綿羊紅細胞和溶血素。指示系統：綿羊紅細胞和溶血素。原理：原理：1 21 12 21 12 21：No Ab； 2：AbAg待測血清待測血清 AbAb陽性陽性No AbNo Ab陰性陰性AgAgAg 抗原：傷寒菌裂解產物抗原：傷寒菌裂解產物 待測血清：待測血清：5656，30min30min 補體：豚鼠血清補體：豚鼠血清 2%2%綿羊紅細胞綿羊紅細胞 溶血素溶血素材料：材料：方法：方法：123450.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 搖勻，搖勻，3737，水浴，水浴15min15min（1 1份份/2/2人）人）預期結果：預期結果：1 1管內液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內液體透管內液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內液體透明呈紅色為溶血。明呈紅色為溶血。溶血溶血不