1、上海市衛生局資助項目,項目編號:2004J003A 通訊作者:方肇勤 T :021-*小鼠氣、血、陰、陽、虛等八種模型四診的比較和評價盧文麗 方肇勤 潘志強 付曉伶(上海中醫藥大學實驗中醫學教研室,上海 201203摘要:為了觀察常見小鼠虛證模型四診表現的異同,及其模型的可靠性,我們依據文獻,分別制作了氣血陰陽各兩種共8個虛證模型,通過同步檢測體重、飲水、攝食、肛溫、尾溫、心率及爪、尾顯微放大拍照及圖像處理得到r 值,對各虛證各模型四診進行比較。初步研究表明,在氣虛方面,環膦酰胺模型屬脾陽氣虛,可能還伴隨血虛和腎虛;番瀉葉模型大體為腹瀉傷津模型,而脾氣虛不是主要的;在血虛方面,乙酰苯肼模型為血

2、虛模型;而尾靜脈放血至血虛模型,需要延長造模時間、增加放血的次數和數量;在陰虛方面,甲狀腺素模型屬陽熱偏盛,陰虛不突出;氫化可的松陰虛模型,接近于陰虛;在陽虛方面,丙基硫氧嘧啶陽虛模型可能要求造模劑量增大和時間延長;而氫化可的松陽虛模型不甚典型。關鍵詞:氣虛;血虛;陰虛;陽虛;動物模型;小鼠在以往的研究中,虛證的報道是最多和最集中的,其中還初步涉及到小鼠四診客觀化的研究,證實小鼠有證可辨1-3。但以往的文獻報道更多是單獨就單一證型或單一模型進行研究,缺少多模型多證型的同步比較,模型的可靠性也缺乏驗證與評估,給證侯和辨證論治的基礎研究提出了新的要求。因此,為能更好的評價常見虛證實驗動物模型,找出

3、相對穩定、敏感的檢測指標,推動小鼠四診客觀化工作的進一步開展,我們進行了本實驗。1 材料和方法 1.1實驗動物清潔級昆明小鼠,18-20g ,雄性,90只,由上海中醫藥大學實驗動物中心提供,動物合格證號:scxk(滬:2003-0003。完全隨機分為9組。1.2儀器與設備MP200B 型電子天平,XD-7100單道心電圖機,自制小鼠心電采集裝置,數字WMY-01型溫度計,SQF-EA 體視顯微鏡,3200K (色溫500W 攝像專用光源,自制光源裝置,NIKON Coolpix4500數碼相機,Photoshop7.0圖像軟件。1.3造模方法在歸納整理以往的文獻報道的基礎上,氣血陰陽四虛證各選

4、取兩種模型,具體如下表: 證型 造模和處理方法 模型起 止時間出處正常組 不作任何處理環瞵酰胺氣虛 環瞵酰胺注射液1mg/10g ,腹腔注射,第1、2天各一次10-14 4 番瀉葉氣虛 番瀉葉水煎劑0.25g/10g ,灌胃,一天一次,8天8-14 5-6 乙酰苯肼血虛 乙酰苯肼6mg/只,皮下注射,第1、4天各一次10-14 8 尾靜脈放血血虛 多次尾靜脈放血,第1、3、5天各一次10-14 9 甲狀腺素陰虛 甲狀腺素混懸液3 mg /10g 灌胃,一天一次,7天8-14 10 氫化可的松陰虛 氫化可的松注射液1mg/10g ,皮下注射, 一天一次,4天 10-14 11丙基硫氧嘧啶陽虛 丙

5、基硫氧嘧啶混懸液0.6mg/10g 灌胃,一天一次,14天1-14 12 氫化可的松陽虛 氫化可的松注射液0.25mg/10g 腹腔注射,一天一次,7天 8-14 13 實驗共21天:依據造模長短時間不同,造模起始時間不相一致,但保證第14天全部造模結束,第15-21天為造模結束后(模型形成后的統一觀察時間。期間共檢測六次,分別為第1、8、10、15、18、21日。1.4檢測指標一般指標:體重、飲水、攝食、肛溫、尾溫、爪和尾顯微放大拍照和圖像處理后的r 值。 1.5 檢測方法第一步:采用Photoshop7.0圖像軟件進行圖像處理,選取爪的掌部及尾部作為RGB 色度的定量分析。作為國際標準色的

6、定量,R 代表紅色,G 代表綠色,B 代表藍色,得到原始爪尾 RGB 14。第二步:校正不同檢測批次間可能存在的采集條件誤差。將第1批正常組小鼠爪R 的平均值,記為RN1,第2次正常組小鼠爪R 的平均值,記為RN2;RN2/ RN1得到一系數,以此系數校正第2批各小鼠。其它各批次每只小鼠依次以RN1分別校正處理。第三步:校正隨機分組后客觀存在的不同組別個體的差異。取第1批90只小鼠檢測到的爪R 值的平均數,記為RT ,同時計算出第1批9個組各自爪R 平均值記為R1,R2R9,分別求出RT/ R1,RT/R2RT/R9等9個校正系數,在以上第二步校正的基礎上,分別以這初始的9個校正系數分別校正各

7、自對應組別內以后各次檢測所得的小鼠數據(各組第二步校正后的數值均除以各組對應的校正系數。第四步:爪G 、B ,尾R 、G 、B 以次類推,得出校正后的爪尾RGB 值。第五步:將校正后的RGB 值帶入公式BG R Rr +=得出校正后的r 值。1.6數據處理方法除飲水攝食外,其它均采用方差分析,方差不齊采用非參檢驗。2 結果與評價2.1環磷酰胺與番瀉葉氣虛模型 圖1不同氣虛造模對體重的影響 圖2不同氣虛造模對肛溫的影響 圖3不同氣虛造模對飲水量的影響圖4不同氣虛造模對攝食量的影響 圖5不同氣虛造模對爪r值的影響圖6不同氣虛造模對尾r值的影響環膦酰胺造模后動物表現為皮毛蓬松,易于捕捉,攝食量、肛溫

8、下降。爪、尾反映紅色程度的r值下降,且持續時間長。提示有明顯的氣虛與陽虛,臟腑定位主要在脾,是脾氣虛、脾陽虛。至于爪色淡,爪、尾r值下降,可能部分屬血虛所為;此外,以往藥理實驗提示有骨髓抑制,是否還與腎虛有關,有待進一步驗證。番瀉葉模型造模后動物自主活動減少,易于捕捉。造模后約1小時,即出現腹瀉,肛周有污物。但是,動物造模后飲水增多;且爪、尾反映紅色程度的r值均上升,不似通常脾氣虛出現爪色淡、飲水減少的表現。肛溫下降原因可能有二:一是番瀉葉藥性偏寒,二是大量腹瀉,因此,具有外來寒邪致病的特點,再鑒于其恢復快,也不似遺傳、體質或慢性疾病脾氣虛、脾陽虛的表現,最多也就是一過性的傷陽。而且,小鼠對番

9、瀉葉造模的適應性強,耐受性形成快。綜合這樣的表現,可以推測,采用本實驗方法,番瀉葉所造成的模型大體為腹瀉傷津模型,脾氣虛不是主要的。因此,作為脾氣虛模型,采用番瀉葉短期造模的價值不大。2.2乙酰苯肼與尾靜脈放血血虛模型 圖7 不同血虛造模對體重的影響圖8 不同血虛造模對肛溫的影響 圖9 不同血虛造模對飲水量的影響圖10 不同血虛造模對攝食量的影響 圖11 不同血虛造模對爪r值的影響圖12 不同血虛造模對尾r值的影響乙酰苯肼模型,動物外觀十分虛弱,嗜臥,扎堆明顯(畏寒,肛溫下降,體重與飲水、攝食均下降;爪色明顯改變,爪色淡,爪、尾反映紅色程度的r值下降。造模結束后動物逐漸出現死亡,推測為劑量偏大

10、所致。肉眼所見爪色伴有一定程度的青紫,是小鼠爪色淡的特殊表現,還是血虛同時伴有血瘀,值得進一步研究。聯系到以往我們觀察到乙酰苯肼造血虛模型小鼠紅血球顯著破壞,因此,乙酰苯肼所造的模型可以肯定地講為血虛模型。至于嗜臥、扎堆(畏寒,肛溫下降,體重、飲水、攝食下降,爪色淡而青紫等一派陽氣虛的表現,可能是大量血細胞破壞和乙酰苯肼大劑量的中毒“氣不附血”的表現,需要進一步的觀察。連續5天、共計3次的放血,難以造成小鼠典型的血虛模型,雖然模型小鼠肛溫有下降趨勢,典型的反映血虛的爪、尾未見明顯的色澤改變,爪r值有下降趨勢,尾r值則相反。總之,結合小鼠肛溫、爪、尾等改變,這樣的造模力度,小鼠尚處于有效代償階段

11、,而體質的下降已初見端倪。因此,適當延長造模時間、增加放血的次數和數量,可能會成為比較好的模擬失血性血虛模型。從造模的角度看,乙酰苯肼模型造模方便、時間短,變化明顯而肯定,易于觀察,易于捕捉規律,是一個比較理想的血虛模型。2.3甲狀腺素和氫化可的松陰虛模型 圖13 不同陰虛造模對體重的影響圖14 不同陰虛造模對肛溫的影響 圖15不同陰虛造模對飲水量的影響圖16不同陰虛造模對攝食量的影響 圖17 不同陰虛造模對爪r值的影響圖18不同陰虛造模對尾r值的影響甲狀腺素模型造模后動物活動度增加,有輕微的躁動;飲水量上升明顯,肛溫有升高趨勢;但是體重卻未見下降、攝食量增加,爪、尾色澤未見明顯變化,甚至反映

12、紅色程度的爪、尾r值還出現下降。綜合以上表現,這樣的造模所形成的不是陰虛模型,而是陽熱偏盛,火不旺(紅色的表現闕如的模型。延長造模時間,可能會見到類似于臨床的甲亢陰虛模型。氫化可的松造模后,動物飲水攝食略有上升,體重下降,爪、尾反映紅色程度的r值上升,有類似于陰虛的表現。但是,動物外在行為表現與正常組比較未見明顯差異,而且肛溫有下降的趨勢,用陰虛難以解釋。總之本模型是一個比較接近陰虛的模型。相比之下,本實驗所造的兩個模型,均不是十分典型。就造模時間看,氫化可的松造模時間短,要方便一些。同時發展其他穩定、方便的陰虛動物模型應該是今后的方向之一。2.4丙基硫氧嘧啶與氫化可的松陽虛模型 圖19 不同

13、陽虛造模對體重的影響圖20 不同陽虛造模對肛溫的影響血模型比較麻煩，小鼠的代償能力強。短期甲狀腺素模型只能是陽盛模型，并非陰虛；氫化可的 松劑量的偏差可以導致不同的證型。丙基硫氧嘧啶模型推測需要較長的造模時間。而在我們前期 的文獻調查中15-18，這些模型的評價還是比較好的。因此，中醫虛證證侯動物模型的摸索和建立， 還有很多工作要做。 在四診檢測指標方面，爪、尾圖像指標 r 值和飲水、攝食及體重的變化比較穩定，而尾溫和 心率次之。就檢測指標的靈敏性而言，爪較尾為靈敏。 在我們以往的研究中，通過顯微照片肉眼識別和圖象處理相結合的判別，發現 R 的相對值 r （即 R 與 R、G、B 總和的百分比

14、）能夠比較客觀地反應小鼠爪色的紅的程度，r 值越大，爪色越 紅，r 值越小，爪色越淡19-23，在本次實驗血虛模型中再次得到了驗證。 中醫藥基礎實驗，要求符合中醫的理論與實踐，我們采用四診合參，以及同步比較不同虛證 造模的異同，達到了預期目的，結論也相對可靠。遵循這種思路與方法，希望能更準確地建立和 評價不同證侯的動物模型，給辨證論治基礎研究奠定堅實的基礎。 參 考 文 獻 方肇勤.中醫基礎證的一原三維研究J.中國中西醫結合雜志, 2002,22(4: 250-251. 方肇勤. 開拓證研究新途徑的思考J.上海中醫藥雜志, 2001, (4: 4-5. 陳曉,陳德溯,方肇勤. 荷瘤小鼠非創傷性

15、辨證指標的對照研究J.中醫雜志, 2003,44(1: 58-59. 王禾 , 吉惠敏 , 韓立君 , 等 . 環磷酰胺模型中醫證型屬性的實驗研究 J. 中國中醫基礎醫學雜 志,1996,2(5:46-49 5 李傳英等.脾虛泄瀉證動物模型的研究J.浙江中醫雜志,1982,17(8:355-357 6 劉 勁 , 曲 長 江 . 三 種 脾 虛 模 型 小 鼠 線 粒 體 超 微 結 構 改 變 的 比 較 研 究 J 中 醫 藥 學 刊,2001,19:378-379 7 陳家旭,陳易新,季紹良,等.瀉下、勞倦因素致脾氣虛大鼠下丘腦、血漿 NPY 含量的變化J.北 京中醫藥大學學報,2002

16、,25(6:22-24 8 賁長恩. 血虛動物模型初討J.上海中醫藥雜志, 1981,(6:38-39 9 陳奇.中藥原理研究方法學M.北京.人民衛生出版社,1993.9:1010 10 李發榮,徐文友,曹永孝.太白參對甲亢型腎陰虛小鼠的影響J.中藥材,2001,24(3:190-191 11 夏洪生,張永鋒,劉立昌,等歸蓉補血片對小鼠陰虛證模型作用的實驗研究J.湖北中醫學院學 報.2001, 3(2:23-24 12 秦 路 平 , 石漢 平 .Osthol 和 Icariin 對 甲 減 小 鼠 血 清 甲 狀腺 素 的影 響 J. 第 二軍 醫 大 學學 報,1998,19(1: 48-

17、50 13 史萬玉,程書梅,包永占.小白鼠氫化可的松陽虛模型的劑量選擇J.中獸醫雜志 1996,(5:15. 14 賈云得編著, 機器視覺, M科學出版社, 2000,150-159. 15 潘志強,方肇勤.小鼠虛證模型實驗研究現狀及發展趨勢J.上海中醫藥大學學報,2003,17(4: 60-63 16 付曉伶,方肇勤.陰虛證動物模型的造模方法及評析J.上海中醫藥大學學報,2004,18(2:51-54 17 李軍蘭,方肇勤.氣虛證動物模型造模方法綜述J.上海中醫藥大學學報, 2004,18(3:56-60 18 盧文麗,方肇勤.陽虛證動物模型的造模方法與評析J.上海中醫藥大學學報,2004,18(4:44-48 19 陳德溯,陳曉,方肇勤. 建立荷瘤小鼠分期辨證方法的初步研究J.中國醫藥學報,2002,17(增 刊: