1、遺傳病的診斷遺傳病的診斷 ( Diagnosis of Hereditary Disease) 可以分為產前診斷、癥狀前診斷和可以分為產前診斷、癥狀前診斷和現癥病人診斷三種類型。遺傳病的診斷是現癥病人診斷三種類型。遺傳病的診斷是開展遺傳咨詢和防治工作的基礎。開展遺傳咨詢和防治工作的基礎。第1頁/共57頁遺傳病的診斷方法遺傳病的診斷方法普遍性診斷原則普遍性診斷原則 是指與一般疾病相同的診斷是指與一般疾病相同的診斷方法，即通過對病史、癥狀、體癥、實驗室檢查和方法，即通過對病史、癥狀、體癥、實驗室檢查和其他診斷技術所獲得的資料進行歸納分析，同時排其他診斷技術所獲得的資料進行歸納分析，同時排除擬診疾病

2、，然后確立診斷。除擬診疾病，然后確立診斷。遺傳學的特殊診斷遺傳學的特殊診斷 主要是指染色體檢查、性主要是指染色體檢查、性染色質檢查、特異性酶和蛋白質以及代謝中間產物染色質檢查、特異性酶和蛋白質以及代謝中間產物的生化分析、的生化分析、DNARNA以及家系分析、皮膚紋理以及家系分析、皮膚紋理分析、攜帶者的檢出等等。分析、攜帶者的檢出等等。第2頁/共57頁一一 病史、家族史和體癥病史、家族史和體癥1. 病史病史由于遺傳病多有家族聚集現象，所以病由于遺傳病多有家族聚集現象，所以病史的采集的準確性非常重要。除關注一般病史的采集的準確性非常重要。除關注一般病史外，主要著重于患者的家族史、婚姻史和史外，主要

3、著重于患者的家族史、婚姻史和生育史。生育史。第3頁/共57頁( 1 ) 家族史家族史 2. 家族史家族史采集家族史時應該特別注意因患者或代述采集家族史時應該特別注意因患者或代述人由于文化程度、記憶能力、思維能力、判斷人由于文化程度、記憶能力、思維能力、判斷能力以及精神狀態而使癥狀、體癥的描述不夠能力以及精神狀態而使癥狀、體癥的描述不夠準確、全面，或者因為患者、代述人提供假材準確、全面，或者因為患者、代述人提供假材料等都會影響家族史的準確性。料等都會影響家族史的準確性。著重了解結婚年齡、次數、配偶健康狀況著重了解結婚年齡、次數、配偶健康狀況以及是否近親結婚等。以及是否近親結婚等。第4頁/共57頁

4、 3 . 生育史生育史著重了解生育年齡、子女數目、健康狀況、著重了解生育年齡、子女數目、健康狀況、有無流產、死產、早產史等。如有新生兒死亡有無流產、死產、早產史等。如有新生兒死亡或患兒，則除詢問父母及家庭成員上述情況外，或患兒，則除詢問父母及家庭成員上述情況外，還應該了解患兒有無產傷、窒息，妊娠早期母還應該了解患兒有無產傷、窒息，妊娠早期母體有無患病毒性疾病和接觸過致畸因素，如服體有無患病毒性疾病和接觸過致畸因素，如服用過致畸藥物或接觸過電離輻射或有害化學物用過致畸藥物或接觸過電離輻射或有害化學物質等。質等。第5頁/共57頁4. 癥狀和體癥癥狀和體癥遺傳病除和其他疾病有相同的體癥之外，往遺傳病

5、除和其他疾病有相同的體癥之外，往往有其本身的往有其本身的特異性癥候群特異性癥候群，為診斷提供初步的，為診斷提供初步的線索。線索。苯丙酮尿癥：苯丙酮尿癥：智力發育不全，特殊腐臭尿液智力發育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血癥：半乳糖血癥：智力發育不全伴有白內障，肝智力發育不全伴有白內障，肝硬化。硬化。第6頁/共57頁1. 由于大多數遺傳病在嬰兒和兒童時期即可有體由于大多數遺傳病在嬰兒和兒童時期即可有體癥和癥狀出現，故除觀察外貌特征外，還應該癥和癥狀出現，故除觀察外貌特征外，還應該注意身體發育情況：諸如體重增長速度，智力注意身體發育情況：諸如體重增長速度，智力增進、性器官以及第二性癥發育、肌肉的張力、增進

6、、性器官以及第二性癥發育、肌肉的張力、嬰兒啼哭的聲音等情況。嬰兒啼哭的聲音等情況。2. 由于有遺傳異質性，若欲作出病因診斷，單憑由于有遺傳異質性，若欲作出病因診斷，單憑體癥、癥狀資料是非常困難的，一定要進行必體癥、癥狀資料是非常困難的，一定要進行必要的實驗室檢查。要的實驗室檢查。診斷中應該注意的問題診斷中應該注意的問題第7頁/共57頁二、系譜分析二、系譜分析系譜系譜 ( Pedigree ) ：將患者家族的所有將患者家族的所有成員及其發病情況按照一定格式排繪制成成員及其發病情況按照一定格式排繪制成的圖解，就成為系譜。的圖解，就成為系譜。系譜分析系譜分析 ( Pedigree Analysis

7、) ：對某對某種性狀或者疾病的多個系譜種性狀或者疾病的多個系譜 進行綜合研究，進行綜合研究，從而得出這種性狀或者疾病的遺傳方式，從而得出這種性狀或者疾病的遺傳方式，稱之為系譜分析。稱之為系譜分析。第8頁/共57頁一例并指癥的系譜一例并指癥的系譜第9頁/共57頁一例多指（趾）的系譜一例多指（趾）的系譜12 2341567123456第10頁/共57頁一例一例-地中海貧血的系譜地中海貧血的系譜12213456789812345679101112設：貧血基因 0 正常基因 A A 0A 0A 0A A重型貧血重型貧血輕型貧血0 0A 0 第11頁/共57頁1211376451091241281316

8、3421535610 11 12 13 14 15一例白化病的系譜一例白化病的系譜第12頁/共57頁一例甲型血友病的系譜21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91第13頁/共57頁2一例抗維生素D性佝僂病的系譜1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91設：致病基因XA 正常基因XaXA XaXaYXAYXAXaXAY第14頁/共57頁進行系譜分析應注意的問題進行系譜分析應注意的問題1. 系譜的系統性、完整性、可靠性。去偽存真。系譜的系統性、完整性、可靠性。去偽存真。2. 分析顯性遺傳病時應注意延遲顯性、不規則顯分

9、析顯性遺傳病時應注意延遲顯性、不規則顯性、外顯不全等。性、外顯不全等。3. 分析性連鎖遺傳病時應注意與從性和限性遺傳分析性連鎖遺傳病時應注意與從性和限性遺傳相區別。相區別。4. 要注意顯隱性的相對性。因為同一種遺傳病采要注意顯隱性的相對性。因為同一種遺傳病采用不同觀察指標會得出不同的結論。用不同觀察指標會得出不同的結論。5. 注意新的基因突變。注意新的基因突變。第15頁/共57頁HbA HbA HbA HbS HbS HbS 正常人正常人 攜帶著攜帶著 患者患者（致死）（致死） 無無 有有（50%） 有有（全部）（全部） 無無 有有（生存力強）（生存力強） - 基因型基因型 疾疾 病病 （隱性

10、）（隱性）鐮形細胞鐮形細胞 （顯性）（顯性）抗抗 瘧瘧 疾疾 （顯性）（顯性）第16頁/共57頁三、生物化學檢查三、生物化學檢查基因突變引起的單基因病往往表現在酶和蛋白質的質與量的改變或者缺如。因此酶和蛋白質的定量分析是診斷單基因病和先天性代謝性的主要方法。第17頁/共57頁1. 代謝產物的檢出代謝產物的檢出酶的缺陷導致一系列生化代謝紊亂，從而導致代酶的缺陷導致一系列生化代謝紊亂，從而導致代謝底物、中間產物、終產物、旁路代謝產物發生改變。謝底物、中間產物、終產物、旁路代謝產物發生改變。因此，檢測某些代謝常物的質和量的改變，可以間接因此，檢測某些代謝常物的質和量的改變，可以間接反映出酶的變化而作

11、出診斷。反映出酶的變化而作出診斷。苯丙酮尿癥苯丙酮尿癥 ：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病粘多糖病 ：尿中的硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素。尿中的硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素。DMD ：血清中的磷酸肌酸酶活性。血清中的磷酸肌酸酶活性。第18頁/共57頁2. 酶和蛋白質的分析酶和蛋白質的分析基因突變導致的單基因病主要是特定基因突變導致的單基因病主要是特定的蛋白質、酶的質和量改變的結果。因此的蛋白質、酶的質和量改變的結果。因此對酶的活性和蛋白質含量的測定是確定某對酶的活性和蛋白質含量的測定是確定某些單基因病的主要方法。些單基因病的主要方法。第19頁/共57頁檢測材料的主要

12、來源有：檢測材料的主要來源有： 特定的組織和細特定的組織和細胞，如肝細胞、皮膚成纖維細胞，腎，腸粘膜胞，如肝細胞、皮膚成纖維細胞，腎，腸粘膜細胞等。細胞等。注意的問題：一種酶的缺乏不一定在所有注意的問題：一種酶的缺乏不一定在所有組織中都能夠檢測出來。例如苯丙氨酸羥化酶組織中都能夠檢測出來。例如苯丙氨酸羥化酶必須用肝組織活檢，而血細胞中無法得到。必須用肝組織活檢，而血細胞中無法得到。第20頁/共57頁上海：上海：19811987年對年對284,396名新生兒進行名新生兒進行PKU篩查，查出篩查，查出PKU患兒患兒15名，高苯名，高苯丙氨酸血癥丙氨酸血癥4名。名。生物化學檢查生物化學檢查 苯丙酮尿

13、癥苯丙酮尿癥, PKU酶活性檢查酶活性檢查 PAH 肝細胞肝細胞血液濾片法血液濾片法 Guthrie test 血液血液FeCl3顯色反應顯色反應 苯丙酮酸苯丙酮酸 尿液尿液第21頁/共57頁四、基因診斷四、基因診斷基因分析，即基因診斷基因分析，即基因診斷 ( Gene Diagnosis )： 是是利用利用DNA 分析技術直接從基因水平分析技術直接從基因水平 ( DNA or RNA ) 檢測遺傳病的基因缺陷。檢測遺傳病的基因缺陷。這種方法和傳統的診斷方法主要差別在于直接這種方法和傳統的診斷方法主要差別在于直接從基因型推斷表型，可以越過基因產物，直接檢測從基因型推斷表型，可以越過基因產物，直

14、接檢測基因的結構而作出診斷，改變了傳統的表型診斷方基因的結構而作出診斷，改變了傳統的表型診斷方式，所以又稱為式，所以又稱為逆向診斷逆向診斷 ( Reverse Diagnosis )。第22頁/共57頁第23頁/共57頁第24頁/共57頁基因診斷的優點基因診斷的優點1. 材料容易獲得，不受細胞類型的限制；材料容易獲得，不受細胞類型的限制；2. 不受基因表達的時空限制。不受基因表達的時空限制。3. 不受年齡的限制；不受年齡的限制；4. 可以于發病前做出診斷；可以于發病前做出診斷；5. 方便有效，迅速準確，攜帶者也可以有效檢方便有效，迅速準確，攜帶者也可以有效檢出。出。第25頁/共57頁 基因診斷

15、的難點：基因診斷的難點：對大多數疾病尚未找到合適的對大多數疾病尚未找到合適的基因診斷方法，另外由于遺傳異質性、基因突變基因診斷方法，另外由于遺傳異質性、基因突變的多樣性，一種基因診斷方法對同一疾病往往有的多樣性，一種基因診斷方法對同一疾病往往有很大差異。很大差異。 基因診斷的對象：基因診斷的對象：一般是指單基因病和某些有主一般是指單基因病和某些有主基因改變的多基因病。基因改變的多基因病。 至至1997年，發現人類單基年，發現人類單基因病遺傳病已達因病遺傳病已達8587種，現已達到種，現已達到15988種種第26頁/共57頁進行基因診斷必須具備的條件：進行基因診斷必須具備的條件：(1)致病基因的

16、染色體定位已明確致病基因的染色體定位已明確(2)致病基因的結構、順序與突變性質巳清楚致病基因的結構、順序與突變性質巳清楚(3)致病基因與致病基因與DNA多態存在連鎖關系多態存在連鎖關系根據所具備的條件選擇適合的基因診斷技術根據所具備的條件選擇適合的基因診斷技術第27頁/共57頁基因診斷方法基因診斷方法 目前常用的基因診斷方法目前常用的基因診斷方法: (1)聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應DNA擴增法擴增法 (2)限制性酶譜限制性酶譜Southern印跡雜交直接分析法印跡雜交直接分析法 (3)限制性片段長度多態性限制性片段長度多態性(RFLP)連鎖分析法連鎖分析法 (4)寡核苷酸探針寡核苷酸探針(oli

17、gonucleotide probe)檢測法檢測法 (5)DNA測序測序 (6)基因芯片基因芯片第28頁/共57頁（一）（一） 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（PCR）是在體外特異）是在體外特異和迅速地擴增特定靶和迅速地擴增特定靶DNA序列的方法序列的方法第29頁/共57頁PCR的原理：的原理：1. 為可選擇性擴增為可選擇性擴增,要要有特異引物有特異引物2. 要有前身物、聚合要有前身物、聚合酶和離子酶和離子3. 是鏈式反應，每一是鏈式反應，每一周期經過變性、復周期經過變性、復性和延伸三步性和延伸三步4. 一周期

18、后一周期后DNA倍增倍增第30頁/共57頁 PCR的過程：的過程： 變性（92-95；1分鐘） 復性（40-60；1分鐘） 延伸（72；1.5分鐘）第31頁/共57頁 5 3 3 5 變性變性 5 3 3 5 特異引物特異引物 復性復性 5 3 5 3 3 5 3 5 DNA聚合酶聚合酶 延伸延伸 3 5 5 3 PCR第32頁/共57頁 以以 地貧基因診斷為例地貧基因診斷為例 由于中國人由于中國人地貧地貧80%以上為東以上為東南亞型缺失型南亞型缺失型 （- -SEA/）, 該突變的該突變的缺失范圍約缺失范圍約20kb基因片段。因此，基因片段。因此， 采用跨越斷裂點采用跨越斷裂點PCR法（法（

19、gap-PCR）,一次即可診斷出各種基因型。一次即可診斷出各種基因型。PCR的應用的應用第33頁/共57頁第34頁/共57頁1 21 2第35頁/共57頁第36頁/共57頁1 2 3 4 5a b1：正常人；：正常人； 2,4,5：純合體患者；：純合體患者； 3：雜合體：雜合體(2的弟弟的弟弟)左為泳動變位模式：左為泳動變位模式：a 正常人；正常人；b 純合體患者純合體患者第37頁/共57頁GAAGAGTGTTATCTCCAC第38頁/共57頁第39頁/共57頁 PCR-DHPLCDHPLC（變性高效液相色譜）（變性高效液相色譜）進行基因突變檢測的原理進行基因突變檢測的原理 DHPLC進行基因

20、突變檢測是基于異源雙進行基因突變檢測是基于異源雙鏈的形成和不同的雙鏈與吸附拄的結合牢固程鏈的形成和不同的雙鏈與吸附拄的結合牢固程度不同。度不同。第40頁/共57頁 一個雜合子個體，一個雜合子個體，PCR產物一定含有野生型和突產物一定含有野生型和突變型兩種變型兩種DNA，并且兩者的比例為，并且兩者的比例為1:1，將，將PCR產物進產物進行變性復性過程，雜交會形成同源雙鏈和異源雙鏈，行變性復性過程，雜交會形成同源雙鏈和異源雙鏈，同樣，當把野生型和突變型同樣，當把野生型和突變型PCR產物混合后，進行變產物混合后，進行變性復性過程，雜交后會出現四種情況。性復性過程，雜交后會出現四種情況。第41頁/共5

21、7頁 異源雙鏈由于堿基對不匹配，在部分變性異源雙鏈由于堿基對不匹配，在部分變性的溫度條件下，就會在不匹配的堿基對處部分的溫度條件下，就會在不匹配的堿基對處部分解鏈，由于單鏈解鏈，由于單鏈DNA帶負電荷減少，結合力弱，帶負電荷減少，結合力弱，因此，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來，根據因此，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來，根據柱子保留時間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分柱子保留時間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，出現不同的檢測峰。離，出現不同的檢測峰。第42頁/共57頁 DHPLC的特點：的特點： 1）快速分離DNA分子，一般進行基因突變檢測，一個樣品約需8.8分鐘 2）自動化操作系統 3）準確測定DNA

22、片段大小 4）基因突變檢出率高，達95-100% 5）經濟、操作簡便、PCR產物無須進行純化處理即可用于突變檢測 第43頁/共57頁（二）分子雜交（二）分子雜交第44頁/共57頁 Southern印跡雜交印跡雜交 (Southern blot hybridization)原理原理: DNA堿基的替換和數目的改變可導堿基的替換和數目的改變可導致限制性酶切片段長度改變致限制性酶切片段長度改變 1. 點突變至酶切位點消失或出現新切點點突變至酶切位點消失或出現新切點 2. 較大片段堿基缺失較大片段堿基缺失 3. 串聯重復數目較大的改變串聯重復數目較大的改變 4. 較大片段堿基重復較大片段堿基重復第45

23、頁/共57頁限制酶的識別序列與切割：限制酶的識別序列與切割： 絕大多數絕大多數型限制酶的識別序列都是型限制酶的識別序列都是 回文結構回文結構, 即即以雙對稱軸按以雙對稱軸按5 3方向閱讀時方向閱讀時,其堿基順序在雙鏈其堿基順序在雙鏈上相同上相同 BamH識別GGATCC 5-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT- 3 3-CCTAGGTACCT TGGCATCGCCTAGGATCA- 5 Bgl識別AGATCT 5-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3 3-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5第46頁/共57頁 探針的種

24、類和標記 DNA第47頁/共57頁 探針標記(probe labeling) 同位素標記: 32P, 35S, 3H 非同位素標記: 生物素，地高辛標記方法標記方法: 缺口平移 雙鏈探針標記 隨機引物 PCR 寡核苷酸標記: 5末端標上標記物第48頁/共57頁1限制性酶譜直接分析法：限制性酶譜直接分析法： 應用專一性基因探針和限制性內切酶，經應用專一性基因探針和限制性內切酶，經 Southern印跡雜交直接檢測致病基因存在印跡雜交直接檢測致病基因存在 原理：原理： 限制性內切酶能識別限制性內切酶能識別 DNA中特定核苷酸順序，中特定核苷酸順序，在正常情況下某種限制性內切酶所切出的片段在正常情況下某種限制性內切酶所切出的片段長度是固定的，當基因發生突變后長度是固定的，當基因發生突變后, 核苷酸順序核苷酸順序發生改變發生改變, 導致限制性內切酶的酶切位點改變，導致限制性內切酶的酶切位點改變，從而使片段長度發生改變。從而使