1、引物設(shè)計(jì)的原理和程序、設(shè)計(jì)原理1、選擇合適的靶序列：設(shè)計(jì)引物之前，必須分析待測(cè)靶序列的性質(zhì)，選擇高度保守、堿基分布均勻的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。2、長(zhǎng)度：一般來(lái)說(shuō)，寡核甘酸引物長(zhǎng)度為15-25bp。3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65C,盡可能保證上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相對(duì)偏低，則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng)，而保證一定的退貨溫度。4、G+*量：有效引物中的G+C含量一般為40%-60%5、堿基的隨機(jī)分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不存在聚喋吟和聚喀咤，尤其在引物的3'端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C。6、引物末端：只有引物的3'端與模板結(jié)合，PC時(shí)能進(jìn)行，所以3

2、9;端最好是G或C7、引物自身：引物自身不存在連續(xù)4個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，否則會(huì)影響到引物與模板之間的結(jié)合，尤其避免3'端的互補(bǔ)。8、引物之間：上下游引物之間盡量少的存在互補(bǔ)序列，否則上下游引物退火結(jié)合，將影響到PCR勺擴(kuò)增效率。二、序列查找根據(jù)所需檢測(cè)的待檢定基因，在網(wǎng)址查詢有關(guān)序列。三、引物設(shè)計(jì)與篩選以BeaconDesigner5.1軟件為例，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和篩選。1、打開軟件，調(diào)入序列F M £時(shí) 丁巾.*，廉* TL Orilh5 -fiJJ'jt 啰中蟲e”/H睡 BuMtm M胃Hhi:虬-C:Fiuki m ffrm-Hnir (1.jucli-Wtrw

3、ulEFEVlui:1. Iji1 Cf=rafl*im F la HBC Prqs rtsiZiftt-rFniiarra dp,*BWTNnrtM| MPMllMj用 M 察，由 hirrMUr4ilflr曾后AuuQf*jP山aUrTt5CHiaL-ih.2/0卜冉電噴L餐。亡力afni-+Crr.Li0414clIiiiii|rtBHljip*|ki.li>B.-U2、選擇序列文件名，加入右框3、序列顯示如圖,4、選擇引物設(shè)計(jì)方式5、點(diǎn)擊“PrimerSearch（圖標(biāo))”，按照引物設(shè)計(jì)的原理，設(shè)定引物的各種參數(shù)，點(diǎn)擊“Search”進(jìn)行引物搜尋6、等待引物搜尋，顯示結(jié)束后，點(diǎn)擊

4、“OK”，進(jìn)入下一頁(yè),7、按照搜尋結(jié)果顯示，逐條分析，點(diǎn)擊“AllStructures”，檢查該引物對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),依次篩選四、引物比對(duì)比對(duì)設(shè)計(jì)的引物是否滿足需要和引物的特異性，在網(wǎng)址進(jìn)行比對(duì)_ _， nr1、輸入所需比對(duì)的序列，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)廿L工HQ：，All>£i"4r*ilZA>事由停二口 J *BLAST一 ，一 E , .O-*Oq同&AajiiAa'n.Eiigan-Blf>ihhiiib-rracn11wrira«+ranhv"Al|i<nInubii-尹*'+!S|aMjiaMii2、點(diǎn)擊“Bl

5、ast”,進(jìn)入下一頁(yè)T NCBIEBLASTd1一玉上”«<，r-wriipir卜金l-*niili方iihiFilnu4iifii|riUpIhtlQjFdrHrrrp-FT-r:>l,T|r-liftrik"ftal*K-r4VUTtFI'lKT0i-H-tBL*nri.-"riI?*廣*1PindI1-fir,11l-iY-IBnJrWifMiimwJIa#bA"iH4-iIt%皆Lk，.1*西|lraU,Hi*|alb3、點(diǎn)擊“Format”,進(jìn)入比對(duì)結(jié)果>I八1'“，!?*1»IKA«TQ.

6、,1««.，“，二；z99«-Utl»"NCBIresult9ofBLASTKIRWIN21UfklvIIk|Al»«74«*4,伊39,r»-wlai«w*4r«fem，sn-mac“n*w*9«w*vtii«t«m“E».I，HtLi9TdMf-MUTi«»mdofrcacAl*.M«cd»pro*.1aal«»oActd«2533M343.M>1，力66”mSfiCeJ64«JLA«TU224M*，«l>“Fl”»，f-t»M«T.T»C99.efwite«Mha«i*eiw”i!mm(!?：-9.(r*©.0f*xKTKra：20.410.5Jfl.e?ew«xlesoItyoubavasdf