1、第一章生物大分子物質的制備w 生命大分子物質通常是指：生命大分子物質通常是指： 動物、植物和微生物在進行新陳代謝時所產生的動物、植物和微生物在進行新陳代謝時所產生的等有機化合物的總稱。等有機化合物的總稱。 生命科學研究將進入。分離純化和測試分析蛋白質技術顯得十分重要。 本章將以蛋白質和核酸為主線討論其制備的一般過程，即材料的選擇與處理、測定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(這部分移至后面的章節介紹)等步驟。 第一節第一節 材料的選擇與處理材料的選擇與處理 一、材料的選擇一、材料的選擇 A. 是指欲純化的某種單一的生命大分子物質。而有效成分以外的其他物質則統稱。 B.B.有效成

2、分在材料中存在的特點有效成分在材料中存在的特點w有效成分的含量一般較少有效成分的含量一般較少 如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。w有效成分穩定性較差有效成分穩定性較差 大多數對酸、堿、高溫和高濃度有機溶劑等因子較敏感，易被微生物分解變質。 選用的材料材料不同，有效成分的含量含量就不同； 選用的材料即使相同，但是部位部位或生長期生長期不同，有效成分的含量也不盡相同。 C.C.材料選擇應遵循的原則材料選擇應遵循的原則w有效成分含量多、穩定性好w 來源豐富、保持新鮮w提取工藝簡單w 有綜合利用價值等 二、材料的處理二、材料的處理 選擇到合適的材料后，應，或采用或等方法處理。 同時還應將易于

3、去掉的非需物質除去。 1 動物臟器動物臟器 (1)冰凍冰凍 應在很短時間內置-10冰庫(可短期保存)或-70低溫冰箱(數月不變質)貯存。 脫脂脫脂 脂肪容易氧化酸敗，導致原料變質，而且還會影響純化操作和制品得率。 一般脫脂的方法有： A.人工剝去臟器外的脂肪組織； B.浸泡在脂溶性的有機溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂； C.采用快速加熱(50左右)、快速冷卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去； D.利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。 (2)干燥干燥 A.丙酮液中脫水，干燥后磨粉貯存備用； B.在沸水中蒸煮處理，烘干后能長期保存。 2 植物組織植物組織 A.葉片葉片 用水洗凈即可使用；

4、 或在l0h內置-4-30冰箱貯藏備用。 B.植物種子植物種子 需泡脹或粉碎才可使用。 材料含油脂較多時，要進行脫脂處理。 3 微生物微生物 為制備生命大分子物質的主要材料之一。 用離心法收集到的上清液， 可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分； 可置低溫下短時間貯存。 收集到的菌體，經破細胞處理后則可從中提取其他有效成分； 或制成凍干粉，在4保存(數月不會變質)。第二節第二節 確立測定方法確立測定方法 一、目的與要求一、目的與要求 測定哪些材料含有目標有效成分？ 哪些材料含量豐富？ 提純過程純度是否逐漸增加？ 要確立專一、準確、靈敏和簡便的測定方法。 因為：有效成分在原材料中含量較低；底物要專

5、一性的。二、常用的測定方法二、常用的測定方法 1 1. .光譜法光譜法2 2. .電化學法電化學法3 3. .生物活性檢測法生物活性檢測法4 4. .免疫分析法免疫分析法5 5. .生物傳感器生物傳感器 1 光譜法光譜法(1)(1)吸收光譜法吸收光譜法 直接測定法；比色法直接測定法；比色法 (2)(2)熒光法熒光法(3)(3)濁度法濁度法 特點： 測定時所需的樣品量較少，但往往能產生比較高的消光值； 且操作簡單，反應迅速、靈敏； 結果也較準確， (1)吸收光譜法吸收光譜法 直接測定法、比色法直接測定法、比色法 直接測定法直接測定法 將待測物(如核酸、蛋白質)配制成一定濃度的溶液后，移至相應波長

6、的分光光度計中， 即可從測定的消光值換算換算出待測物的含量含量。 A.A.測定核酸含量測定核酸含量 構成核酸的堿基組分是分光光度計測定核酸含量的依據。 在測定過程中，DNA或RNA溶液濃度的增加或降低，會使其在波長260nm的消光值(A260) 隨之增加或降低，二者之間成正比關系。 通常1個A260值分別相當于 雙鏈DNA 50gml 單鏈DNA 37gml 單鏈RNA 40gml 用A260A280比值可確定DNA和RNA的純度： 純DNA比值為1.8 純RNA的比值為2.0 當此比值分別小于1.8和2.0時，表明樣品中已污染了蛋白質或酚類等物質。 B.測定蛋白質的含量及純度測定蛋白質的含量

7、及純度 蛋白質(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由構成蛋白質組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值決定的，胱氨酸的貢獻很小。 比色法比色法 將待測物(如蛋白質、核酸、糖類)與相關試劑(見表1-2)或酶的底物作用后，根據呈現的顏色或形成的產物特性，移至相應波長的分光光計中，即可從測定的消光值換算出待測物的含量。 例如： 鄰苯二酚鄰苯二酚( (在在275275nmnm有吸收峰有吸收峰) ) + + 鄰苯二酚鄰苯二酚-2-2,3-,3-雙加氧酶雙加氧酶 黃色的黃色的- - 羥基粘康酸半醛羥基粘康酸半醛( (在在375375nmnm有吸收峰有吸收峰) ) 通過檢測375nm消光值的升高即可

8、換算出所用酶的活力。 還可用不同消光值之間的比值鑒定某些物質的純度 例如 純細胞色素c還原型A550氧化型A280比值為1.25 1.28。 假如比值過高或過低，就表明細胞色素C中污染了雜質。 (2)(2)熒光法熒光法 特點： 熒光法的精確性、重復性和靈敏度比吸收光譜法好。 當分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測時，改用熒光法卻能求得滿意結果。 如： NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（輔酶） NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（輔酶） 由于NADH2和NADPH2發熒光，用于偶聯NADH2 (或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的還原反應系統進行熒光測定。 例子： 谷草轉氨酶(GOT)活

9、力測定w采用與蘋果酸脫氫酶（MDH)相偶聯反應進行。 天冬氨酸 +- 酮戊二酸 GOT 草酰乙酸 + 谷氨酸 草酰乙酸 + NADH+H+ MDH L - 蘋果酸+NAD+w每生成1分子草酰乙酸分子草酰乙酸就消耗消耗1分子NADH，這樣GOT活力就可通過測定NADH在340nm消光值的下降來求得。 (3)(3)濁度法濁度法 極稀的懸浮液懸浮液可采用此法測定，即測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。 例如 伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力測定方法之一就是采用此法(A420)。 培養液中細菌生長的濃度(A600) 也可用此法測定。 2 電化學法電化學法 有些反應過程會放

10、出質子氫(H+)，可用靈敏的pH計或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計算出欲測物的或。 例如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定該酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。 3 生物活性檢測法生物活性檢測法 大多數生命物質，尤其是一些物質，當把它們注射入動物的特定器官時，所屬機體將發生相應的變化，并且二者間有一定的相關性。根據這一性質設計的方法，即可對生命活性物質進行檢測。 如：在某個動物器官中注射某種激素，使器官細胞加速分裂，通過檢測細胞的數量變化來推測激素的生物活性。 4 免疫分析法免疫分析法 采用之間發生的特異反應，并結合放射性同位素標記或酶標記，就可對有關物質

11、進行靈敏的定性或(和)定量分析(詳見第十九章)。 5 生物傳感器生物傳感器 用生物傳感器中的具有分子識別功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗體、生物膜和微生物等作為敏感元件）與待測溶液中的某一進行反應，即可通過顯示器反映出有效成分的數量(詳見第十七章)。 第三節第三節 細胞的破碎細胞的破碎 細胞是生物體的基本單位。 有效成分可以分泌于細胞外分泌于細胞外，也有存在于細胞內的。存在于細胞內的。 如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培養液中，用適當的溶劑可直接提取。 存在于細胞內的存在于細胞內的酶又有游離酶有游離酶和結合酶結合酶之分，前者游離在細游離在細胞質中胞質中，后者則與細胞器緊密結合與細胞器緊密結合

12、(如氧化還原酶和有機磷水解酶等)。 w 欲提取存在于細胞內的物質時，必須（個別的則例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。w 動物臟器的，極易破損，往往在組織絞碎或提取時就被破壞了。w植物和微生物的，需要在提取前進行專門的破細胞操作。一、機械破碎一、機械破碎1 研磨法研磨法剪碎的動物組織置研缽中，用研磨棒研碎。 用勻漿器勻漿器處理，也能把動物細胞破碎。 大規模生產時，可用電動研磨法電動研磨法。 細菌和組織的細胞破碎均可用此法。 2 組織搗碎器法組織搗碎器法這是一種劇烈的破碎細胞方法。搗碎器(8 00010000r/min)處理3045s，植物和動物細胞能完全破碎。 3 超聲波法超聲波法 它是借助的

13、振動力破碎細胞壁和細胞器的有效方法。 4 壓榨法壓榨法 此法是一種溫和、徹底破碎細胞的方法。 用1.771083.54108Pa的壓力迫使幾十毫升通過一個(20kDa)或甘油中。 10ml抽提液可在1h內濃縮到幾乎無水的程度。 這種方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數量有密切關系。 B.真空透析 五、減壓蒸餾法五、減壓蒸餾法當真空度較高時溶液的沸點可控制在當真空度較高時溶液的沸點可控制在3030以下。以下。 這種方法一般適用于常溫下穩定性好的物質。這種方法一般適用于常溫下穩定性好的物質。 六、冰凍干燥法 冰凍的抽提液在真空狀態下，可以由。用此原理進行濃縮，有效成分幾乎不會破壞。 凍干機

14、 凍干機主要由：低溫干燥箱、真空泵和冷凍機構成。 第六節第六節 純化方案的設計與評價純化方案的設計與評價 純化方案：純化方案： 是指在純化某一物質過程中，將幾種分離方法(如沉淀法、離子交換層析、葡聚糖凝膠等)有機地互補聯合、靈活應用的總稱。 一、純化方案的設計一、純化方案的設計 依據抽提液中和之間理化性質的差異性，從諸多方法中挑選出兩種、兩種以上乃至更多種分離方法組成一個純化方案。 各分離方法的排布： 一般地，選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工序處理的方法； 選用精確、費時和需樣品量少的方法。 二、純化方案的評價二、純化方案的評價 對純化方案的評價，實質上是對組成純化方案的每一種分離方法

15、的評價。 這種評價僅采用理論分析是遠遠不夠的，只有經過實踐檢驗才能正確得出。 方法：純化過程的每一步收集到的溶液要進行：的含量測定； 并計算：(活力單位數毫克蛋白)(每步的比活力粗抽提液的比活力)(每步的總活力/粗抽提液總活力）100 視的大小，的高低，就能初步確定每種分離方法的。w 一般認為：凡是在特定實驗中能增大純化倍數和提高收得率的方法均屬有應用價值的。反之，則應用價值不大，也不宜采用。 w但是，在純化過程中，隨著純化倍數的增大，有效成分的含量卻是逐漸減少，收得率也往往100(除非抽提液中存在酶的抑制)。 w 因此，實踐中對純化倍數和收得率的要求是根據材料來源的難易而變化的。若材料來源難

16、，就希望提高收得率；反之，則希望提高純化倍數(見沉淀法)。 例子 以從賽氏桿菌(Serratia sp)提取L-門冬酰胺酶為例，說明純化方案與純化倍數和收得率的關系(見表1-7)。表表1-5 L-門冬酰胺酶的純化門冬酰胺酶的純化活力單位數毫克蛋白= 每步的比活力粗抽提液的比活力= 每步的總活力/粗抽提液總活力100步驟步驟 總蛋白總蛋白/g 總活力總活力/u 比活力（比活力（u/mg） 純化倍數純化倍數 收得率收得率/%1.粗抽提液粗抽提液 30 21000 0.7 1 100 2.氯化錳處理氯化錳處理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰凍融解冰凍融解 5.58 14872 2.

17、7 3.8 714.DEAE-纖維纖維 0.113 5025 44.5 63.5 24 素層析素層析5.硫酸銨鹽析硫酸銨鹽析 0.048 3367 71.7 102.0 176.羥基磷灰石羥基磷灰石 0.016 3133 200.0 286.0 15 柱層析柱層析7.PAGE 0.012 3100 255.0 365.0 15此處，是用表示用表示 純化的不同，表示其含量和相對純度的單位亦不一樣。 如純化的物質是胰島素，其將用表示，用單位表示。 第七節第七節 有效成分純度和性質的分析有效成分純度和性質的分析 在實踐中 常用于鑒定生物制品的方法有：電泳(見第十八章)、免疫分析(見第十九章)、薄層層析和薄膜層析(見第三章)等。 用于檢測其的方法有：光譜法和氣相層析(見第二十章)等； 用于測定有效成分的方法有：凝膠過濾(見第六章)和電泳法等； 用于測定的方法有：化學直讀法、酶解直讀法(見第十三章)等； 用于測定的方法有：與Endman降解法相結合的薄膜層析等。 第八節第八節 應用實例應用實例 葉綠體的提取與葉綠體的提取與4.5S RNA的制備的制備 葉綠體提取緩沖液： 0.3molL甘露糖醇或0.3molL蔗糖 4mmolL EDTA-Na2 50mmolL Tris-HCl(pH80) 5mmolL巰基乙醇 0.05牛血