1、HPLC測定紅曲中7種核苷類成分的含量HPLC測定紅曲中7種核苷類成分的含量 1 儀器與試藥 1.1 儀器JA11002B電子分析天平0.011100 g上海周密科學儀器有限公司、BSA224S0.0001220 g和BT25S0.0000121 g型分析天平德國Sartorius公司、智能超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司、Agilent 1100型高效液相色譜儀美國Agilent、Avium 611VF超純水機德國Sartorius公司。1.2 試藥胞苷購自大連美侖生物技術有限公司批號：150515；肌苷、尿嘧啶、胸苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、腺苷購自中國食品藥品檢定討論院批號分別為：14066

2、9-202106，100469-202102、101215-202101、140661-202103、110886-202102、110879-202103。檢測過程中使用的試劑均為色譜純及超純水。2 方法與結果2.1 色譜條件接受RP-HPLC法，色譜柱Shiseido C184.6 mm×250 mm，5 m；乙腈A-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀B二元線性梯度洗脫：09 min，0%A；940 min，0%8%A；流速1 mL/min；柱溫30；檢測波長254 nm；進樣量20 L。接受超純水作為陰性對比溶液。見圖1。2.2 對比品溶液制備分別周密稱取核苷類對比品適量，加超純

3、水制備成尿嘧啶50 g/mL、胞苷61.4 g/mL、次黃嘌呤55.7 g/mL、腺嘌呤468.7 g/mL、肌苷114.3 g/mL、胸苷52.9 g/mL、腺苷111.4 g/mL的溶液，備用。2.3 供試品溶液制備粉碎紅曲，過40目篩，稱取粉末3 g，周密稱定，加入具塞錐形瓶中，周密加入超純水30 mL，超聲提取20 min，過濾。錐形瓶及紅曲殘渣用適量超純水洗滌，過濾，合并濾液轉移至50 mL容量瓶中，超純水定容至容量瓶刻度，搖勻，0.45 m微孔濾膜過濾，備用。2.4 線性關系考察周密吸取尿嘧啶1 mL、胞苷2 mL、次黃嘌呤2 mL、腺嘌呤1 mL、肌苷1 mL、胸苷1 mL和腺苷

4、2 mL對比品溶液，制備成系列混合對比品溶液，其濃度范圍為尿嘧啶1.005.00 g/mL、胞苷3.0815.35 g/mL、次黃嘌呤2.7813.95 g/mL、腺嘌呤9.3746.87 g/mL、肌苷4.5822.86 g/mL、胸苷1.065.29 g/mL、腺苷4.4122.28 g/mL，周密吸取20 L混合對比品溶液注入高效液相色譜儀，按“2.1項下色譜條件測定。以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，計算回來方程。結果顯示，對比品濃度在肯定范圍內與峰面積的線性關系良好。見表1。2.5 周密度試驗周密吸取20 L混合對比品溶液，其濃度為尿嘧啶5.00 g/mL、胞苷15.

5、35 g/mL、次黃嘌呤13.95 g/mL、腺嘌呤46.87 g/mL、肌苷22.86 g/mL、胸苷5.29 g/mL和腺苷22.28 g/mL，及同一供試品溶液，根據“2.1項下色譜條件進行檢測，重復6次，記錄標準品混合溶液、供試品中核苷色譜峰面積。尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷對比品溶液RSD為0.61%、1.47%、1.44%、0.51%、0.61%、0.77%、0.63%；供試品溶液RSD為1.46%、1.42%、1.24%、1.49%、1.08%、1.10%、1.52%。提示儀器周密度良好。2.6 穩定性試驗分別于0、2、4、6、8、10 h周密吸取20 L同一

6、供試品溶液，根據“2.1項下色譜條件進行檢測，記錄結果。在10 h內，供試品溶液中尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷峰面積RSD分別為1.73%、1.46%、1.16%、1.68%、1.11%、1.67%、0.89%。提示供試品溶液在10 h內穩定。2.7 重復性試驗周密稱取同一批次樣品6份，根據“2.3項下供試品溶液制備方法進行制備，并根據“2.1項下色譜條件進行檢測，記錄結果。尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷含量RSD分別為1.33%、1.62%、1.55%、1.47%、1.87%、1.56%、1.45%，提示重復性良好。2.8 加樣回收率周密稱取1.5 g已

7、知含量的紅曲樣品6份批號：170205，加入肯定量的核苷對比品，根據“2.3項下供試品溶液制備方法制備，并根據“2.1項下色譜條件進行檢測，計算含量及加樣回收率。加樣回收率結果見表2。結果說明該方法精確性良好。2.9 紅曲中7種核苷類成分含量測定取不同批次的紅曲樣品，根據“2.3項下供試品溶液制備方法制備紅曲供試品溶液，并根據“2.1項下色譜條件進行檢測，結果見表3。3 商量本討論考察了Shiseido C184.6 mm×250 mm，5 m、Agilent TC184.6 mm×250 mm，5 m和Thermo C184.6 mm×250 mm，5 m色譜柱

8、，其中Shiseido C184.6 mm×250 mm，5 m色譜柱的分別效果及峰型最優?？疾炝肆魈氏嘁译?、甲醇及水、甲酸水、磷酸水的不同組合和比例，結果乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀作為流淌相組合的分別度及峰型最優。本討論分別對超聲提取及回流提取進行了考察，超聲提取法對紅曲樣品的所用提取時間最短，紅曲中提取出的核苷類含量高，因此本討論提取方法為超聲提取法。提取溶劑的選擇上，考察了不同體積比的甲醇-水系統，結果超純水作為提取溶媒時，核苷類化合物出峰多，且紅曲中所檢測的核苷含量高。 本討論紅曲中7種核苷尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷在肯定濃度范圍內與其峰面積呈良好的線性關系r 0.9995，方