1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法驗(yàn)證方案起草人起草日期審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期廈門市邕試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法驗(yàn)證方案目的范圍1責(zé)任人1內(nèi)容11.實(shí)驗(yàn)材料及用具12實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備13.具體驗(yàn)證步驟23.1. 宜試劑靈敏度復(fù)核23.2.干擾實(shí)驗(yàn)43.3.供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查64.驗(yàn)證結(jié)論8附：表1.宜試劑靈敏度復(fù)核記錄表2.干擾試驗(yàn)記錄表3.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查記錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法驗(yàn)證方案目的：為確保復(fù)方氨基酸注射液（18AA-HI）細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法的專屬性、靈敏度，保證檢測(cè)結(jié)果可符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，特制定此方案。范圍：復(fù)方氨基酸注射液（18AA-HI）細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法責(zé)任人：細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)員、QC主

2、管內(nèi)容：1.2.1.0. .實(shí)驗(yàn)材料及用具1. 電子天平1. 電熱干燥箱1. 恒溫水浴箱1. 水銀溫度計(jì)1. 旋渦混合器1. 宜試劑（具有國(guó)家主管部門的批準(zhǔn)文號(hào)）1. 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1. 實(shí)驗(yàn)用具：移液管、凝集管、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、時(shí)鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。2實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備3.2. 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入銘酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來(lái)水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸儲(chǔ)水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。3.3. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻

3、璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250C,待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計(jì)時(shí)，干烤至少1小時(shí)。達(dá)到規(guī)定時(shí)間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。3.具體驗(yàn)證步驟3.1.4. 賞試劑靈敏度復(fù)核3.1.5.2. 實(shí)驗(yàn)操作3. 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過(guò)程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將

4、瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進(jìn)行稀釋，制備成4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2入、入、0.5入、0.25入（入為所復(fù)核的賞試對(duì)的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。3. 待復(fù)核賞試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的賞試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。3. 口樣將已充分溶解的待復(fù)核賞試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1ml的2入、入、0.

5、5入、和0.25入的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水。3. 加樣結(jié)束后，將賞試劑用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37c±1C水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2分鐘。3. 觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動(dòng)，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180。觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（+）;未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）3.1.6.2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如最大濃度2.0入，4管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25入，4管均為陰性，陰性對(duì)照為陰性時(shí)實(shí)驗(yàn)為有效，按下式計(jì)算反應(yīng)

6、終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為宜試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（入c）入c=ig-1（EX/4）式中x為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。3.1.7.2. 果判斷3. 判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)入c在0.5入2入（包括0.5人和2入）時(shí)判定該批宜試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以入（標(biāo)示靈敏度）為該批賞試劑的靈敏度。3. 判斷結(jié)果：（記錄附后）擾實(shí)驗(yàn)操作方法目的是檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于賞試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)所使用的賞試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液取1支細(xì)菌

7、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2入、入、0.5入、0.25入（方法同3.1.1.1.）。制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將3.2.3.1.中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個(gè)濃度即2入、入、0.5入、0.25人的含內(nèi)毒素的供試品溶液宜試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的賞試劑36支，輕彈壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。口樣將準(zhǔn)備好的賞試劑取其中18支（管）放在試管架上，排成5列，4歹U4

8、支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0入、1.0入、0.5入、0.25人的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對(duì)照。將另外18支（管）邕試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的含2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的內(nèi)毒素的供試品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對(duì)照。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37±1C水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如兩組最大濃

9、度2.0人均為陽(yáng)性，最低濃度0.25人均為陰性，陰性對(duì)照,管均為陰性時(shí)，按下式計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）.ES=lg-1（EXs/4）E=lg-1（EXt/4）X、X分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。結(jié)果判斷判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)Es在0.5入2.0入（包括0.5入和2.0入）時(shí)，且Et在0.5Es2.0ES（包括0.5Es和2.0E）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，可在該濃度下對(duì)此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。當(dāng)Et不在0.5Es2.0E（

10、包括0.5Es和2.0E）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實(shí)驗(yàn)。判斷結(jié)果：（記錄附后）3.3.供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)必須做2支陽(yáng)性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。操作方法供試品溶液的制備：（稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2入濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（方法同3.1.1.1.）。供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用待檢測(cè)的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2入濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同3.2.1.3.2,供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備）。3.3.1.4.陰性對(duì)照液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水宜試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.

11、1ml/支的賞試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。加樣取8支（管）溶解好白試劑，其中2支加入0.1ml供試品溶液或其稀釋液（其稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD）作為供試品管，2支加入0.1ml陽(yáng)性對(duì)照溶液作為陽(yáng)性對(duì)照管（PC）,2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對(duì)照管（NC）,2支加入0.1ml供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管（PPC）。將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37C土1C水浴或適宜恒溫器中，保溫60土2分鐘。保溫和取放試管過(guò)

12、程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。結(jié)果判斷判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性、供試品陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性且陰性對(duì)照都為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)有效。若供試品2管均為陰性，認(rèn)為該供試品符合規(guī)定；如供試品2管均為陽(yáng)性，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；如2管中1管為陽(yáng)性，1管為陰性，按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中如有1管為陽(yáng)性，即認(rèn)為不符合規(guī)定。若第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而結(jié)果出現(xiàn)2管均為陽(yáng)性或2管中1管為陽(yáng)性時(shí)，按同樣方法復(fù)試，復(fù)試時(shí)要求將其稀釋至MVD。判斷結(jié)果：（記錄附后）4.驗(yàn)證結(jié)論賞試劑靈敏度復(fù)核記錄檢驗(yàn)?zāi)康臋z驗(yàn)日期檢驗(yàn)依據(jù)室溫試劑名稱生產(chǎn)單位批號(hào)靈敏度/效價(jià)規(guī)格賞試劑EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：反應(yīng)結(jié)果保溫時(shí)間（60min）內(nèi)毒素濃度EU/ml2入入0.5入0.25入()()()()陰性對(duì)照終點(diǎn)濃度結(jié)果計(jì)算結(jié)果判斷檢驗(yàn)人員校對(duì)人員干擾試驗(yàn)記錄檢品名稱檢驗(yàn)日期生產(chǎn)單位室溫供樣單位規(guī)格批號(hào)包裝檢驗(yàn)依據(jù)內(nèi)毒素限度試劑名稱生產(chǎn)單位批號(hào)靈敏度/效價(jià)規(guī)格邕試劑EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水實(shí)驗(yàn)操作1.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：2,供試品制備：3.含供試品內(nèi)毒素溶液的制備：反應(yīng)結(jié)果保溫時(shí)間（60min）內(nèi)毒素濃度EU/ml2入入0.5入0.25入()()()()陰性對(duì)照終點(diǎn)濃度重1標(biāo)準(zhǔn)復(fù)2對(duì)照管3數(shù)4重