1、培訓內部講義36顯微鏡概念：廣泛定義，能夠將微觀世界的物質形態展現在人眼前的設備就是顯微鏡。狹隘定義，光學顯微鏡鋼鐵組織圖片（光學顯微鏡）蜘蛛照片（電子顯微鏡）人眼觀察的局限性盡管科技在不斷的發展，眼睛作為視覺器官同位于后面的大腦相配合，依然是目前最有效的成像系統。所有的科學儀器在速度和分辨率上與眼睛都無法相提并論。眼睛的構造類似于攝像機。肌肉調節的水晶體（ 1a）與角膜（1）的曲面將一幅圖像投射在視網膜（2）上。入射光的強度則通過改變虹膜（3）的直徑來控制。通過這種方法，眼睛可以把位于大約20cm 到無限遠距離內的任意物體，經由水晶體，靠肌肉靈活調節焦距，從而形成一幅清晰的圖像。圖像本身將會

2、投射在視網膜上，經由大約130 百萬個柱狀受體（識別黑白色）以及7 百萬個圓錐細胞（識別彩色）識別后，在最短的時間內，通過視神經傳送至大腦。下圖是的光線經由眼睛形成的視角為30°之后的圖示，都是在同樣的視角下觀看。從300m 遠的地方眺望161m 高的烏爾姆大教堂（位于德國南部）。從25cm 處觀看一幅高13cm 的相片。視角小意味著什么？因為我們想要進一步觀察植物莖部的細微的毛細管，我們從莖部切出一片非常薄的切片，將它放置載 玻片上并用蓋玻片保護。當拿著做好的樣品迎著光來觀察時，我們依然無法觀察到更多的細節。僅僅能觀 察到與之前一樣的的組織。這些問題的原因很容易解釋。我們想要觀察的

3、細節大概只有1/100 甚至 1/1000 個毫米。然而在20cm以內，眼睛無法聚焦到20cm 內任意位置。結果是我們得不到任何細節。類似情形就像我們要在300m 遠的地方去觀察先前提到的烏爾姆教堂的塔尖。在這么遠的距離上，石匠們所創造出許許多多的花紋將無法分辨出來，其原因就在于視角太小了。補救方法：放大鏡一個幾個世紀以來就眾所周知的解決方法：放大鏡。當把放大鏡放在眼睛與被觀察的物體之間時，所有的物體都被放大了。然而這種方法的局限性是：放大倍數要超過8 倍或者 10 倍是不可能的。任何人想要觀察更多的細節就必須使用“復合式”放大鏡。如果一個透鏡的放大倍數不足以滿足我們的需要，那么可以將若干個透

4、鏡一個接一個的排列起來。此時的放大效果將會是乘積式增大,即形成了顯微鏡。顯微鏡的發展史：早在公元前一世紀，人們就已發現通過球形透明物體去觀察微小物體時，可以使其放大成像 ，后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規律有了認識。1590 年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經造出類似顯微鏡的放大儀器。1610 年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結構，當時的光學工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。17 世紀中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發展作出了卓越的貢獻。1665 年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調焦機構、照明

5、系統和承載標本片的工作臺。這些部件經過不斷改進，成為現代顯微鏡的基本組成部分。1673 1677 年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動、植物機體微觀結構的研究方面取得了杰出的成就。19世紀 70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。在顯微鏡本身結構發展的同時，顯微觀察技術也在不斷創新：1850 年出現了偏光顯微術；1893 年出現了干涉顯微術；1935 年荷蘭物理學家澤爾尼克創造了相襯顯微術，他為此在1953 年獲得了諾貝爾物理學獎顯微鏡的成像原理當把待觀察物體放在物鏡焦點外側靠近焦點處時，在物鏡后所成的實像恰在目鏡焦

6、點內側靠近焦點處，經目鏡再次放大成一虛像。觀察到的是經兩次放大后的倒立虛像透鏡的成像缺陷像差像差就是指理想的成像和光學系統的實際成像之間的差異。無像差的成像，即理想成像的條件必須滿足下述三點：（ i ） 由一個點發出的、通過成像光學系統的所有光線應該歸結于同一點。（ ii） 與光軸垂直的、同一平面上各點的成像點應該在同一平面上。（ iii ） 與光軸垂直的、同一平面上的物體平面形狀應該與成像平面上的形狀有相似關系。但是，在實際的光學系統中，完全滿足理想成像的條件很難做到，往往存在著影響成像性能的“像差”1、 色差： 色差 是不同顏色的光線穿過透鏡之后匯聚在不同焦距上的現象。色差分為位置色差和放

7、大率色 差兩種。位置色差使像在任何位置上觀察都帶有色斑與暈環，使圖像模糊不清。放大率色差使像帶有彩色邊緣，同樣影響像的清晰度和分辨率。色差的校正：1 、采用單色光源，但在日常工作中，單色光源無法獲得真實的彩色圖像信息，往往很少采用。2、利用凸、凹透鏡組進行色差校正。是常規手段。2、球差：亦稱球面像差。軸上物點發出的光束，經光學系統以后，與光軸夾不同角度的光線交光軸于不同位置，因此，在像面上形成一個圓形彌散斑，這就是球差球差會使一個光點成像后不再是一個亮點，而是一個中間亮，邊緣逐漸模糊的亮斑。球差的校正依然采用凸凹透鏡組來實現。3、 慧差：彗差屬軸外點的單色像差。軸外物點以大孔徑光束成像時，發出

8、的光束通過透鏡后，不再相交一點，則一光點的像便會得到一逗點壯，型如彗星，故稱“彗差 ”。慧差因為會形成一個模糊的亮斑，因此會破壞圖像的真實和清晰度。慧差的校正與球場的校正方式一樣，都是通過凸凹透鏡組來實現的。4、 像散：當視場很大時，邊緣上的物點離光軸遠，光束傾向大，經透鏡成像后則引起象散。象散會使圖 像形成一個橢圓形的斑點，同樣會影響圖像的真實與清晰度。5、 場曲：場曲因大視場所引起，使得圖像變得彎曲。6、 畸變：畸變是由于光束傾向度大而引起的，使像平面上個處的放大率不同，像的各部分表現出與原物 體不成比例。顯微鏡的結構光源（燈箱）燈箱，提供用戶獲得圖像的光源，多采用鹵素燈作為照明燈泡。分為

9、反射光照明光源和透射光照明光源兩 種。反射光照明用戶觀察不透明或半透明材料，透射光照明用戶觀察透明材料。現有廠家的顯微鏡都采用 柯勒式照明方式。透射光科勒照明反射光科勒照明功能模塊盒用于放置觀察分析模塊（棱鏡）分干涉等分析模塊。模塊盒所能放置的模塊個數各廠家的顯微鏡是有差異的。也是考量顯微鏡研究級別高低的一個參數。有些廠家的模塊轉換采用轉盤形勢，有些廠家采用推拉方式。功能模塊盒物鏡轉盤物鏡轉盤用戶放置物鏡的地方， 各廠家不同類型顯微鏡物鏡轉盤所能放置的物鏡個數也不相同，顯微鏡 倍數的改變就是通過撥轉物鏡轉盤改變觀察物鏡來實現的。放置個數的多少也是衡量顯微鏡研究級別高低 的一個參數。物鏡是由若干

10、個透鏡組合而成的一個透鏡組。組合使用的目的是為了克服單個透鏡的成像缺陷，提高物鏡 的光學質量。顯微鏡的放大作用主要取決于物鏡，物鏡質量的好壞直接影響顯微鏡映像質量，它是決定顯 微鏡的分辨率和成像清晰程度的主要部件。物鏡一、物鏡參數-數值孔徑數值孔徑又叫做鏡口率，簡寫為N.A。它是由物體與物鏡間媒質的折射率n 與物鏡孔徑角的一半（a2）的正弦值的乘積，其大小由下式決定：N.A=n*sin a/2數值孔徑簡寫NA（ 蔡司公司的數值孔徑簡寫CF），數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低（即消位置色差的能力,蔡司公司的數值孔是代表消位置色差和倍率色差的能力）,的重要

11、標志。其數值的大小，分別標科在物鏡和聚光鏡的外殼上。顯微鏡觀察時，若想增大NA 值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率 值。基于這一原理，就產生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率 值大于1， NA 值就能大于1 。數值孔徑與其它技術參數有著密切的關系，它幾乎決定和影響著其它各項技術參數。它與分辨率成正比，與放大率成正比，焦深與數值孔徑的平方成反比，NA 值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。二、物鏡參數-分辨率分辨率是指顯微鏡能夠區分的兩個清晰點之間的最小距離。分辨率的高低決定了獲得圖像組織細節信 息的多少。500 倍圖像效果1000 倍圖像效果分辨率計算公式為：注明：利

12、用公式所得到的分辨率為理論值，實際顯微鏡獲得的分別率根據樣品的不同、周圍光線環境的不 同、顯微鏡技術的不同會有較大的變化。因此通過公式計算的分別率只具有指導意義，不同廠家的實現技 術不同，其獲得的實際分辨率效果往往具有一定差距。 提高分辨率的方法：1、 利用短波長的光作為光源，但因為現有光學顯微鏡往往采用可見光作為光源以保證圖像的顏色信息的 真實性，因此更為有效的方式應該是增加短波長的通過率，在這一點上只有蔡司做的極為專業。2、 增加 NA 值， 因為物鏡在制作完成后其NA 值已經固定不變，因此實際所采用的手段就是更換物鏡（高級別物鏡、高介質折射率物鏡、更高倍數物鏡）。3、 增加明暗反差，采用

13、光路處理技術，降低光路中雜散光對成像質量的影響，也可以提高分辨率。-放大倍數顯微鏡的放大倍數：是指物體經物鏡放大在經過目鏡放大后，人眼所看到的圖像大小與原物體大小的比值。顯微鏡常用的放大倍數有5、 10、 20、 50、 100幾個倍數，有些倍數現有市場只有部分用戶會使用如1.25、4、 5、 63、 150 等。 顯微鏡的放大倍數是指長度的放大，而不是指面積的放大。顯微鏡總的放大倍數=物鏡放大倍數×目鏡的放大倍數。目鏡常用的放大倍數為10 倍，也被稱為標準放大倍數，因此顯微鏡的總放大倍數最高不會超過 1000 倍。有效放大倍數：對于某一顯微鏡而言，在其可分辨能力之內的圖像放大，叫做

14、有效放大。此時的圖像放大不失圖像表面的細節。無效放大倍數：顯微鏡分辨能力以外的圖像放大，叫做無效放大，無效放大只放大了圖像的輪廓，而不能放大和分辨圖像表面的細節。四、物鏡參數-景深（焦深）景深：對焦點前后景物較為清晰的范圍，即為景深。從對焦點至物鏡前的最近清晰點為景深前界限，從對焦點至后面的最遠清晰點為景深的后界限。從前界限至對焦點為前景深，從對焦點至至景深的后界限為后景深前后景深之和為全景深，簡稱景深。前景深的清晰范圍小于后景深約為全景深的1/3。顯微鏡景深的計算公式：其中 K 為常數 240um ， M 為顯微鏡總放大倍數通過公式我們可以了解到景深與放大倍數和分辨率是成反比的，因此在要求高

15、數值孔徑獲得高分別率是一定會導致景深的降低。通過計算我們也可以知道顯微鏡的景深范圍大致是從幾微米零點幾個微米。這就要求我們的樣本表面的高低起伏應該在微米級別內方可獲得一幅清晰圖像。因此顯微鏡下觀察的樣品都需要制樣（使用的常用設備為切割機、鑲嵌機、磨拋機）。因為樣品的制備水平與實際操作人員的操作水平有一定的關系，因此高分辨率下的顯微鏡對于磨樣人的水平是有一定嚴格要求的，也可以說只有在保證樣品表面高低起伏在景深允許范圍內的情況下，高分辨率才有意義。五、物鏡參數工作距離工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。隨著數值孔徑的增大（分辨率的提高）工作距離會縮短，在某些特殊行業，對于物

16、鏡的工作距離是有特殊要求的， 例如高溫金相顯微鏡，因為物鏡需要與熱臺保持足夠長的工作距離，以避免溫度過高而損害物鏡，因此在相同倍數情況下，需要使用長工作距離物鏡，因此也就損失了分辨率。物鏡的分類：1、 根據使用的介質折射率的不同：干燥系物鏡，以空氣作為介質，多用于材料學領域水浸系物鏡，以水作為介質，多用戶生命科學領域油浸系物鏡，以香柏油作為介質，物鏡外殼上標有OIL 的字符，多用戶煤炭、石油、地質等行業。2、 根據色差校正程度的不同：消色差物鏡,物鏡外殼上常有（Ach）字符，現在各廠家很少對其標準，結構比較簡單，僅能校正軸上點的位置色差（紅、蘭二色），成本較低。復消色差物鏡，結構復雜，采用特種

17、玻璃或螢石、氟石等材料制作，物鏡外殼上標有APO 符合。這種物鏡可校正紅、綠、藍三色光的色差。對于各種像差的校正也極為完善，比相同倍數的消色差物鏡具有更高的數值孔徑。適用于高級研究。蔡司的AOP 物鏡可對七色光進行色差校正。半復消色差物鏡，物鏡外殼上標有FL 符號， 有些廠家不標，色差校正程度介于消色差物鏡和復消色差物鏡之間。是國內各進口顯微鏡廠家經常配的一種物鏡。3、 平場物鏡，因為物鏡都要進行場曲的校正，因此現在各廠家生產的物鏡都為平場物鏡，因此在物鏡叫法上就有了平場消色差物鏡，平場半復消色差物鏡，平場復消色差物鏡的叫法。4、 無應變物鏡（偏光專用物鏡），這種物鏡在透鏡組的裝配中克服了應力

18、的存在，用于專業的偏光顯微鏡觀察，物鏡外殼上標有PO 或 POL 的符號。5、 長工作距離物鏡，在材料學領域主要用于高倍高溫金相顯微鏡領域。物鏡的其他概念 合軸：就是在進行鏡檢時，當用某一個倍率的物鏡觀察圖像清晰后，在轉換另一倍率的物鏡時，象的中心 偏離應在一定允許范圍內。 齊焦：就是在進行鏡檢時，當用某一個倍率的物鏡觀察圖像清晰后，在轉換另一倍率的物鏡時，其成象亦 應基本清晰。 全系統齊焦：在滿足齊焦和合軸的基礎下，計算機上所顯示的圖像也是清晰的，蔡司的就是全系統齊焦。載物臺載物臺也叫鏡臺, 在物鏡的下方或上方，用以放置需要觀察的標本，形狀有方、圓兩種，中央有一通光孔（反射光載物臺沒有），載

19、物臺上可裝配彈簧夾，用以夾持標本，載物臺下有推進器調手柄，可使標本作左右、前后方向的移動。載物臺的設計要具有超強的耐久性和便于標本的觀察，即顯微鏡的操作更為穩定、更加耐用。根據不同用途的顯微鏡，其形狀、大小、承重、結構亦有所不同。方形臺調焦機構調焦機構用于調整載物臺與物鏡之間的工作距離，以保證樣品能夠處于物鏡的焦點處獲得最佳的圖像效果。對于正立式顯微鏡，調焦機構控制載物臺的上下移動，對于倒置式顯微鏡，調焦機構控制物鏡轉盤的上下移動。調焦機構分內、外兩個調焦旋鈕，內側的大圈為粗調，外測的小圈的微調。粗調節器（粗螺旋）：大螺旋稱粗調節器，移動時可使鏡臺作快速和較大幅度的升降，所以能迅速調節物鏡和標

20、本之間的距離使物象呈現于視野中，通常在使用低倍鏡時，先用粗調節器迅速找到物象。細調節器（細螺旋）：小螺旋稱細調節器，移動時可使鏡臺緩慢地升降，多在運用高倍鏡時使用，從而得到更清晰的物象，并借以觀察標本的不同層次和不同深度的結構。調焦機構要求機構精密且穩定，長時間使用不會出現齒輪咬合不緊，導致載物臺或物鏡轉盤下滑的現象。目鏡也是顯微鏡的主要組成部分，它的主要作用是將由物鏡放大所得的實像再次放大，從而在明視距離處形成一個清晰的虛像；因此它的質量將最后影響到物像的質量。某些目鏡（如補償目鏡）除了有放大作用外，還能將物鏡造像過程中產生的殘余像差予以校正。常用的目鏡放大倍數有：8× 、10&#

21、215; 、 12.5 × 、 16× 等多種，標準放大倍數為10 倍。目鏡的作用是把物鏡 放大的實像（中間像）再放大一遍，并把物像映入觀察者的眼中，實質上目鏡就是一個放大鏡。已知 顯微鏡 的分辨率能力是由物鏡的數值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。因此，對于物鏡不能分辨出的結構，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。目鏡的視場數：在目鏡上除了標有放大倍數外，還標有市場數，通常的參數有18、 20 、 22、 23、25 、 26.5 等，用于計算實際觀察市場的大小即視場直徑。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑 23-25

22、最為科學，大視場容易引起場曲。F=FN/Mob F: 視場直徑，FN ：視場數，Mob: 物鏡放大率。視場數（Field Number, 簡寫為 FN ），標刻在目鏡的鏡筒外側。由公式可看出：1 視場直徑與視場數成正比。2 增大物鏡的倍數，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。視頻采集顯微鏡的成像除了可以通過目鏡進行觀察外，圖像往往要進行存儲，并通過相關軟件進行分析。在光學出口處，我們可以采用兩種類型的視頻采集設備，數碼照相機和工業用數字攝像頭。A640 。優點：成本低廉，數碼照相機：采用民用數碼照相機的某些品牌和型號的產品，

23、如佳能 除了可用戶顯微圖像采集外，還可以用戶日常工作和生活拍照。缺點，成像質量較差。工業用數字攝像頭：工業用數字攝像頭分為兩大類，CCD 感光靶面和CMOS 感光靶面。市場上主流產品為CCD 類型的。工業用數字攝像頭基本參數有，像素（常用130 萬、 300 萬、 500 萬、1200 萬像素） ，靶面尺寸（1 英寸、 1/2 英寸、 2/3 英寸、 3/4 英寸） 。優點，成像質量高。缺點，成本較高。對于用戶來說，300 萬像素的攝像頭都可以滿足用戶的基本需要，過高的像素會對計算機硬件提出極高的要求，采集照片時容易發生延時效應。顯微鏡的觀察方式（分析功能）對于不同特性的材料，光學顯微鏡會采用

24、不同的觀察分析功能來實現對材料組織結構的有效分析，常用的觀察方式有明場、暗場、偏光、微分干涉、熒光等。一、明場1 、 工 作原理：入射光通過聚光鏡（透明材料）或物鏡（不透明材料或半透明材料）垂直照射到樣品上，照亮樣品的光透過樣品或經樣品表面反射經過物鏡放大成像，在通過目鏡放大被人眼觀察。因為大部的光會進入目鏡，因此整個圖像的視野是明亮的，故成為明場。2 、 應 用，明場主要用于分析樣品的組織全貌，適用于所有材料，是最基本的分析觀察方式。暗場3 、 工 作原理：利用丁道爾現象，入射光通過暗場聚光鏡或物鏡的暗場聚光環，與樣品表面 成一定的角度照射樣品，并且入射過不會通過物鏡進行放大，樣品表面的漫反

25、射光經過 物鏡放大成像后，在經過目鏡進行觀察。因此整個視野背景是黑暗的，只有部分組織邊 緣或微小顆粒能夠成像。4 、 應 用：暗場觀察功能主要用于觀察明場下所觀察不到的細小顆粒和晶界邊緣，但在實際 應用過程中能夠用到暗場的用戶很少。三、偏光1 、 原 理：晶體根據其結構特性分為各向同性晶體（以金屬材料為主）和各向異性晶體（以非金屬材料為主）。各項異性材料的組織結構需要采用偏振光方能觀察到，偏光主要用于分析具有各項異性的非金屬材料。自然光和偏振光光是一種電磁波，屬于橫波（振動方向與傳播方向垂直）。一切實際的光源，如日光、燭光、日光燈及鎢絲燈發出的光都叫自然光。這些光都是大量原子、分子發光的總和。

26、雖然某一個原子或分子在某一瞬間發出的電磁波振動方向一致，但各個原子和分子發出的振動方向也不同，這種變化頻率極快，因此，自然光是各個原子或分子發光的總和，可認為其電磁波的振動在各個方向上的幾率相等。自然光在穿過某些物質，經過反射、折射、吸收后，電磁波的振動可以被限制在一個方向上，其他方向振動的電磁波被大大削弱或消除。這種在某個確定方向上振動的光稱為偏振光。偏振光的振動方向與光波傳播方向所構成的平面稱為振動面。偏光分析功能主要是通過起偏器將自然光轉換為偏振光，偏振光經過樣品后在通過檢偏器（分 析鏡）后，利用目鏡進行觀察與分析。比較常用的偏光觀察方式為正交偏光即起偏器與檢偏器 旋轉角度垂直的狀態。2

27、 、 應 用，觀察各向異性的非金屬材料微分干涉相襯1 、 原 理：自然光先經過起偏器成為偏振光，而后在經過干涉棱鏡（也叫干涉滑尺）分開角度很小的相干光。偏振光由于樣品表面粗糙程度的不同，突起位置會第一時間反射回去，而凹陷位置會延遲一個時間反射，因此將這些信息反映到圖像上，就可以形成表現樣品表面高低起伏的圖像信息。2 、 應 用，反映樣品表面的高低起伏狀態五、熒光，因熒光觀察分析功能多用于生命科學領域，在材料學領域僅有部分石油和地質行業的用戶會涉及到熒光分析，因此在這里將不作詳細介紹！光學顯微鏡的種類一、 金相顯微鏡金相顯微鏡主要用于鑒定和分析金屬內部結構組織,它是金屬學研究金相的重要儀器,是工

28、業部門鑒定產品質量的關鍵設備,該儀器配用攝像裝置,可攝取金相圖譜,并對圖譜進行測量分析,對圖象進行編輯、輸出、存儲、管理等功能.。金相顯微鏡又可分為正立式和倒置式兩種。兩者的區別為：正立式顯微鏡光路短，光路設計簡單，光損少，制樣要求高，樣品高度有要求，方便多視場觀察，鏡頭不 易落灰易維護，適用于研究單位。倒置式顯微鏡光路長，光損較大，光路設計較復雜，制樣要求較低，對樣品高低無要求，檢測方便快速， 不適合多視場分析，同等配置下倒置顯微鏡的價格要高于正立式顯微鏡。倒置式顯微鏡偏光顯微鏡偏光顯微鏡是專用于各向異性非金屬材料檢測的專業顯微鏡。除了配有專業的起偏器和檢偏器外，往往還需要配置其它專用設備，例如，可360 度旋轉的專用載物臺。而金相顯微鏡的載物臺多是方形臺。偏光顯微鏡的基本要求：1、 通常配置360 度旋轉的載物臺2、 需要偏光專用物鏡，在錐光觀察情況下尤為重要3、 可升級錐光觀察功能4、 可配置各類補償片偏光鏡檢術的方式a.正相鏡檢(Orthscope) :又稱無畸變鏡檢，其特點是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡(BertrandLens) ,被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。當起偏檢偏處在交位置時，視野完全變黑，把樣品放在載物臺旋轉一周，如果視野仍為黑，則說明是單折射體，如是為四明四暗則為