1、一、冷凍干燥過程研究 真空冷凍干燥是先將制品凍結(jié)到共晶點(diǎn)溫度以下，使水分變成固態(tài)的冰，然后在適當(dāng)?shù)臏囟群驼婵斩认拢贡A為水蒸氣。再用真空系統(tǒng)的冷凝器(水汽凝結(jié)器)將水蒸氣冷凝，從而獲得干燥制品的技術(shù)。該過程主要可分為：制品準(zhǔn)備、預(yù)凍、一次干燥（升華干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存五個(gè)步驟。 1 產(chǎn)品預(yù)凍 1.1 制品的玻璃化玻璃化的作用。近年來，人們已經(jīng)逐漸地認(rèn)識(shí)到，凡是成功的低溫保存，細(xì)胞內(nèi)的水均以玻璃態(tài)的形式被固化，在胞內(nèi)不出現(xiàn)晶態(tài)的冰。玻璃化是指物質(zhì)以非晶態(tài)形式存在的一種狀態(tài)，其粘度極大，分子的能動(dòng)性幾乎為零，由于這種非晶體結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散系數(shù)很低，故在這種結(jié)構(gòu)中分子運(yùn)動(dòng)和分子變性反

2、應(yīng)非常微弱，不利的化學(xué)反應(yīng)能夠被抑制，從而提高被保存物質(zhì)的穩(wěn)定性。玻璃化的獲得。在產(chǎn)品預(yù)凍時(shí)，只要降溫速率足夠快，且達(dá)到足夠低的溫度，大部分材料都能從液體過冷到玻璃態(tài)固體。“足夠快”的意思是在降溫過程中迅速通過結(jié)晶區(qū)而不發(fā)生晶化，“足夠低”指的是必須把溫度降到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg以下。對(duì)于具有一定初始濃度的細(xì)菌制品，其預(yù)凍過程一般通過“兩步法”來完成。第一步是以一般速率進(jìn)行降溫，讓細(xì)胞外的溶液中產(chǎn)生冰，細(xì)胞內(nèi)的水分通過細(xì)胞膜滲向胞外，胞內(nèi)溶液的濃度逐漸提高；第二步是以較高速率進(jìn)行降溫，以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)溶液的玻璃化。此法又稱“部分玻璃化法”。 當(dāng)初始濃度為A的溶液（A點(diǎn)）從室溫開始冷卻時(shí)，隨著溫度的下降

3、，溶液過冷到B點(diǎn)后將開始析出冰，結(jié)晶潛熱的釋放又使溶液局部溫度升高。溶液將沿著平衡的熔融線不斷析出冰晶，冰晶周圍剩余的未凍溶液隨溫度下降，濃度不斷升高，一直下降到熔融線(Ta)與玻璃化轉(zhuǎn)變曲線(Tg)的交點(diǎn)(D點(diǎn))時(shí)，溶液中剩余的水分將不再結(jié)晶(稱為不可凍水)，此時(shí)的溶液達(dá)到最大凍結(jié)濃縮狀，濃度較高，以非晶態(tài)的形式包圍在冰晶周圍，形成鑲嵌著冰晶的玻璃體。 1.2降溫速率與預(yù)凍溫度預(yù)凍速度決定了制品體積大小、形狀和成品最初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分鐘降溫1左右。對(duì)結(jié)晶性制劑而言，凍結(jié)速度一般不要太慢，凍結(jié)速度慢雖然便于形成大塊冰晶體，維持通暢的升華通道，使升華速度加快，但如果結(jié)晶過大

4、、晶核數(shù)量過少、制劑的結(jié)晶均勻性差，也不利于升華干燥。對(duì)于一些分子呈無規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子藥物，速凍能使其在藥液中迅速定型，使包裹在其中的溶媒蒸汽在真空條件下迅速逸出，反而能使升華速度加快。因此，溶液的最佳冷凍速度是因制劑本身的特性不同而變化的。如蛋白多肽類藥物的凍干，慢速凍結(jié)通常是有利的，而對(duì)于病毒、疫苗來說，快速降溫通常是有利的。20世紀(jì)60年代，人們成功地保存了哺乳動(dòng)物的某些細(xì)胞，其降溫程序是：以1/min降到-15，然后以4-5/min降到-79，這一程序與前面所提及的“兩步法”是一致的。但也有降溫更慢和更快的事例，如紅細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞的最佳冷卻速率超過50/min，而保存淋巴細(xì)胞的降溫

5、速率只有0.1/min。預(yù)凍溫度須低于制品的玻璃態(tài)和橡膠態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，以保證箱內(nèi)所有的制品溫度都低于共熔點(diǎn)，使其全部凝結(jié)成固體；對(duì)于許多溶液，它們的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度一般要比共晶點(diǎn)低10-30°。至于預(yù)凍的最終溫度是控制在低于共晶溫度還是低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，這主要取決于我們希望制品在凍結(jié)過程中所達(dá)到的固化狀態(tài)。對(duì)于具有類似膜結(jié)構(gòu)或活性成分制品的冷凍干燥，應(yīng)盡量使其最終凍結(jié)溫度低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。一般制品預(yù)凍溫度在共熔點(diǎn)以下10-20保持2-3h，保證冷凍完全；多數(shù)疫苗的共熔點(diǎn)在-15到-20之間，因此預(yù)凍溫度要在-25到-40。目前最常用的一種冷凍方法是凍干機(jī)板層冷凍。 2一次干燥 一次干

6、燥（升華干燥）是指低溫下對(duì)制品加熱，同時(shí)用真空泵抽真空，使其中被凍結(jié)成冰的自由水直接升華成水蒸氣。待成品中看不到冰時(shí)，則可認(rèn)為一次干燥已完畢，此時(shí)制品溫度迅速上升，接近板溫，制品中最初水分的90%以上已被除去。2.1一次干燥中制品溫度的控制在升華干燥過程中，制品吸收熱量后所含水分在真空下升華成水蒸氣，消耗大量熱能，使得制品溫度較板層溫度低十幾甚至幾十度。多數(shù)動(dòng)物用疫苗一次干燥應(yīng)在-30或以上溫度（低于產(chǎn)品塌陷溫度尤其是共熔點(diǎn)溫度）下進(jìn)行，因此板層溫度一般在-10-3之間。如果溫度過高，會(huì)出現(xiàn)軟化、塌陷等現(xiàn)象，造成凍干失敗；如果溫度過低，不僅給制冷系統(tǒng)提出了過高的要求，而且大大降低了升華過程的速

7、率，費(fèi)時(shí)又耗能。盡管在有些場(chǎng)合下，一次干燥的最大許可溫度由制品的相變溫度或共晶溫度決定，但更一般的情況下，預(yù)凍的制品中都有一定份額的無定形態(tài)，故應(yīng)當(dāng)將凍干的一次干燥過程控制在Tg以下進(jìn)行。在干燥過程中，如制品干燥層溫度上升到一定數(shù)值時(shí)，其部分干燥物質(zhì)所形成的多孔性骨架剛度降低，干燥層內(nèi)顆粒出現(xiàn)脫落，直至骨架塌陷，造成已被干燥部分的微孔通道被封閉，阻止升華的進(jìn)行，使升華速率減慢，最終可導(dǎo)致凍干產(chǎn)品的殘余水分含量過高，產(chǎn)品的復(fù)水性與穩(wěn)定性差。此時(shí)的溫度稱為塌陷溫度Tc。塌陷溫度Tc是在凍干過程中樣品所特有的特征溫度，是由制品材料及干燥層的多孔性結(jié)構(gòu)所決定。有人認(rèn)為，在多數(shù)情況下，塌陷溫度Tc要比玻

8、璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg高20°左右。對(duì)于一個(gè)特定的凍干制品，其共晶溫度、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度可通過DSC（差式掃描量熱法）測(cè)得，而塌陷溫度可通過凍干顯微鏡和介電分析測(cè)得。目前大多數(shù)的操作，都是在整個(gè)升華干燥過程中保持加熱溫度不變。關(guān)于是否應(yīng)當(dāng)這樣，存在兩種不同的觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，在升華干燥階段，隨著水分的升華，使制品濃度升高，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度也會(huì)提高，這樣升華干燥過程中就可以適當(dāng)逐漸提高溫度，加快升華進(jìn)行；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，在升華干燥階段，升華的只是游離在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)空隙中的自由水，不會(huì)對(duì)物料實(shí)體的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度產(chǎn)生影響，因此升華干燥過程中的加熱溫度仍應(yīng)保持不變。實(shí)際上這兩種情況都可能出現(xiàn)，是和冷卻

9、固化的情況有關(guān)的。2.2一次干燥中冷阱溫度的控制冷阱位于真空泵進(jìn)口前，升華產(chǎn)生的水蒸氣靠壓差的作用到達(dá)冷阱，重新結(jié)成霜，如果沒有冷阱或其溫度不夠低，就會(huì)導(dǎo)致凍干室內(nèi)水蒸汽壓升高，制品升華界面壓力和溫度都會(huì)上升，導(dǎo)致制品融化。對(duì)于多數(shù)制品的冷凍干燥，冷阱表面溫度在-40-50之間已能滿足要求。2.3一次干燥中的真空度一次干燥中真空度應(yīng)維持13.33-26.66pa。一般說來，在升華干燥過程中真空度是維持不變的，但也可以采用循環(huán)壓力法，即控制真空系統(tǒng)的壓力在一定范圍內(nèi)上下波動(dòng)，以期提高干燥速度。大量研究表明，在干燥過程中短期地略微提高干燥室壓力（10-20Pa），同時(shí)干燥層表面溫度維持在接近其允許

10、值，可以縮短干燥時(shí)間。但干燥室壓力必須低于升華界面壓力，而升華界面的壓力所對(duì)應(yīng)的升華界面溫度必須低于制品在相應(yīng)濃度下的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。在升華過程中，有時(shí)可采用向凍干箱內(nèi)充注氣體，以形成對(duì)流傳熱，但這一部分空氣量會(huì)降低真空度，因此，要對(duì)真空度進(jìn)行控制，使其既能形成恰當(dāng)?shù)膶?duì)流傳熱，又能使制劑表面始終處于勻速干燥的壓力狀態(tài)。2.4影響干燥效率的因素在一次干燥過程中，除了制品溫度、冷阱溫度、干燥室壓力影響干燥快慢以外，預(yù)凍速度也影響著升華效率。慢凍形成大冰晶，升華后形成大的孔隙，有利于升華進(jìn)行，干燥速度快；速凍形成細(xì)小的冰晶，升華后留下細(xì)小的通道，干燥速度慢。但慢凍時(shí)，溶質(zhì)可能發(fā)生遷移，以至于在表面形

11、成一層硬殼，阻止升華進(jìn)行。近年來發(fā)現(xiàn)，在凍干配方中加入5%左右叔丁醇后，凍結(jié)時(shí)會(huì)形成針狀結(jié)晶，冰晶升華后留下了管狀通道，使水蒸氣阻力大大減小，升華速率顯著提高，節(jié)省了時(shí)間和能耗。 3 二次干燥 二次干燥（解吸干燥）是在較高的溫度下對(duì)制品加熱，使制品中被吸附的部分“束縛水”解吸變成“自由”的液態(tài)水再吸熱蒸發(fā)成水蒸氣的過程，加熱量主要用于被束縛水的解吸作用和蒸發(fā)。由于升華干燥之后，在干燥制品的多孔結(jié)構(gòu)表面和極性集團(tuán)上結(jié)合水的吸附能量很大，因此必須提供較高的溫度和足夠的熱量才能實(shí)現(xiàn)結(jié)合水的解吸過程。該過程中，制品的含水量不斷減少，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度是不斷提高的，制品溫度也可以逐漸提高。在二次干燥過程中

12、，板層溫度至少每小時(shí)增加5-10。成品溫度應(yīng)該迅速升至板層溫度或以上，否則制品水分增多且易倒塌。二次干燥目的雖然是使殘存在多孔疏松狀固體中的水被去除，但適當(dāng)?shù)乃郑ㄍǔ?-1.5%）對(duì)于保持疫苗結(jié)構(gòu)完整性和活性也是必要的。制品水分過低，菌體表面親水基團(tuán)失去保護(hù)，會(huì)直接與氧接觸，影響菌體的存活率。最終板層溫度是成品水分含量的一個(gè)主要決定因素，其數(shù)值不能超過制品的最高允許溫度，對(duì)于蛋白質(zhì)藥物其最高允許溫度一般應(yīng)低于40，對(duì)于絕大多數(shù)動(dòng)物用疫苗，最終板層溫度應(yīng)該在25-35之間。一般細(xì)菌性產(chǎn)品最終板層溫度為30-35，病毒性產(chǎn)品為25。 4 密封保存凍干結(jié)束后，通過板層液壓升降系統(tǒng)，將半加塞的疫苗瓶

13、在真空狀態(tài)下密封。使用的管狀玻璃瓶和膠塞應(yīng)配套，將其密封后置45水浴24小時(shí)，觀察疫苗瓶中是否有水被吸入。真空密封的完整性應(yīng)在溫度壓力下評(píng)估，簡(jiǎn)單的試驗(yàn)是將成品在45水浴24小時(shí)，觀察疫苗瓶中是否有水被吸入。膠塞應(yīng)該在135干燥4小時(shí)，高壓滅菌膠塞可使疫苗的水分提高2-5%。二、叔丁醇在凍干制劑中的應(yīng)用研究冷凍干燥工藝已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于藥物制劑的制備過程中。通常情況下，水是惟一的溶劑，但有時(shí)候藥物在萃取和結(jié)晶過程中殘留的有機(jī)溶劑，也可能會(huì)被帶入到最后的凍干溶液中，這樣會(huì)導(dǎo)致一些新的變化，含少量有機(jī)溶劑的溶液的凍干工藝引起人們的關(guān)注，并被深入研究。叔丁醇-水共溶劑就是其中最常見的，以它為溶劑進(jìn)行

14、冷凍干燥的工藝可以用于多種制劑的制備，具有多方面優(yōu)勢(shì)。由于叔丁醇作為凍干劑具有多重優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于制劑中，純的叔丁醇可以單獨(dú)作為溶劑，溶解水不溶性藥物或水中穩(wěn)定性不好的藥物，進(jìn)行凍干。國內(nèi)外研究較多是叔丁醇與水形成共溶劑體系進(jìn)行冷凍干燥，其在藥劑領(lǐng)域中應(yīng)用有多方面。制備固體制劑具明顯優(yōu)勢(shì)難溶于水的藥物溶于叔丁醇中，水溶性物質(zhì)溶解于水中，兩者以適當(dāng)?shù)谋壤旌希玫娇梢怨餐芙馑苄耘c脂溶性物質(zhì)的澄明共溶劑，此溶液經(jīng)進(jìn)一步凍干可以得到固體分散體。采用這種工藝制備藥劑具有多種好處。加快藥物的升華速度 研究發(fā)現(xiàn)，將溶解慶大霉素的叔丁醇溶液與乳糖水溶液以合適的比例混合形成共溶劑后凍干，其凍干周期可由3

15、9小時(shí)縮短為28小時(shí)，同時(shí)所得凍干產(chǎn)品仍保持多孔性。提高藥物的穩(wěn)定性 前列腺素E為穩(wěn)定性很差的藥物，采用體積分?jǐn)?shù)為20%的叔丁醇-水共溶劑將藥物和乳糖共同溶解，凍干后得到穩(wěn)定凍干粉針。目前，采用此凍干工藝生產(chǎn)的前列腺素E無菌粉末制劑已在國外上市。增溶難溶性藥物 Aldipine是一種從海洋生物中提取的抗癌活性物質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為1109，在水中幾乎不溶。研究人員探索到一種新的增溶方法：將藥物先溶于叔丁醇中，再與乳糖水溶液按體積比46的比例形成澄明共溶劑，進(jìn)行凍干，得到穩(wěn)定的凍干物，使用前采用聚氧乙烯蓖麻油-乙醇-水共溶劑系統(tǒng)來復(fù)溶，生理鹽水稀釋后注射給藥。簡(jiǎn)化制備固體分散體工藝 最近，研究人

16、員將脂溶性藥物連同水溶性寡糖共溶于叔丁醇-水共溶劑體系，凍干后制成固體分散體。采用此方法可以將脂溶性藥物分散在一些玻璃化溫度較高的無定型輔料中，使藥物保持在無定型狀態(tài)，可顯著提高藥物的溶解速度和藥物的溶解度。這種工藝可以避免用熔融法制備固體分散體對(duì)熱穩(wěn)定性差的藥物的破壞，也能避免采用溶劑法制備固體分散體時(shí)使用氯仿、二氯甲烷等毒性較大的溶劑。促進(jìn)藥物結(jié)晶 叔丁醇-水共溶劑體系制備固體分散體可以使藥物保持在無定型狀態(tài)。另一方面，叔丁醇也可用來促進(jìn)難結(jié)晶藥物的結(jié)晶。這是因?yàn)椋宥〈嫉募尤霑?huì)改變水的結(jié)晶狀態(tài)，進(jìn)而也會(huì)使溶在水中的藥物結(jié)晶狀態(tài)發(fā)生改變。對(duì)抗生素頭孢噻吩鈉的研究發(fā)現(xiàn)，加入少量的叔丁醇可以使

17、很難結(jié)晶的藥物得到針狀的結(jié)晶。磷霉素鈉屬難凍結(jié)的物質(zhì)，因?yàn)樗幬锖退慕Y(jié)合力很強(qiáng)，形成水合物的凝固點(diǎn)急劇下降到零下50左右，普通的凍干機(jī)很難將其凍結(jié)，同時(shí)很低的溫度也使藥物的凍干周期大大延長。而加入叔丁醇后，由于叔丁醇與水的結(jié)合力較強(qiáng)，使得共溶劑系統(tǒng)的凝固點(diǎn)升高，同時(shí)大大地提高了升華速度。制備多種分散體系制備脂質(zhì)體 以叔丁醇作為溶劑溶解磷脂，經(jīng)凍干后得到結(jié)構(gòu)疏松的磷脂固體，加入水可以迅速水化制成脂質(zhì)體。這種方法類似薄膜分散法，可以制得粒徑較大的微米級(jí)多室脂質(zhì)體，這種脂質(zhì)體制備工藝已經(jīng)應(yīng)用于試驗(yàn)和規(guī)模生產(chǎn)。最近，沈陽藥科大學(xué)的科研人員發(fā)明了一種新的脂質(zhì)體制備工藝，即將相變溫度低的大豆磷脂溶于叔丁醇

18、，進(jìn)一步與蔗糖水溶液按適當(dāng)比例混合，得到澄明溶液，凍干得到固體分散體，加水水化，即可得到粒徑均勻的小單室脂質(zhì)體。該工藝解決了脂質(zhì)體穩(wěn)定性不好的問題，建立了一個(gè)形成小單室脂質(zhì)體的模型。在凍干過程中，磷脂的叔丁醇溶液先析出結(jié)晶，這種結(jié)晶的形成被黏度較大的糖溶液限制，只能形成較小的粒徑。同時(shí)，在析出結(jié)晶這個(gè)相分離的過程中，磷脂作為一種表面活性劑，吸附在兩相的界面上，降低表面張力，即磷脂包裹的叔丁醇分散在糖基質(zhì)中，最終形成一種類似乳劑的狀態(tài)。吸附在兩相界面的磷脂在凍干過程中隨叔丁醇升華，形成定向排列磷脂雙分子層片斷，由于雙分子片斷足夠小，水化后形成了小單室的脂質(zhì)體。研究人員針對(duì)相變溫度高的飽和磷脂，設(shè)

19、計(jì)了另一種工藝，即將其溶于叔丁醇，在實(shí)驗(yàn)溫度大于相變溫度時(shí)注入到水中，形成脂質(zhì)體，再進(jìn)行凍干得到凍干脂質(zhì)體。此方法可縮短凍干周期。研究證明，將飽和磷脂DMPC-DMPG(摩爾比為73)與蒽環(huán)類抗癌藥Annamycin以質(zhì)量比501的比例溶于叔丁醇-二甲基亞砜-水共溶劑體系，并加入表面活性劑吐溫-80，冷凍干燥制成凍干粉末，水化后也可得到亞微米級(jí)的脂質(zhì)體。制備非離子表面活性劑囊泡 磷脂以外的一些非離子表面活性劑，也可以與水溶性介質(zhì)共溶于叔丁醇-水體系，冷凍干燥得到凍干分散體，水化后得到非離子表面活性劑囊泡。制備高聚物膠團(tuán) 一些高分子共聚物可以與脂溶性藥物形成膠團(tuán)，增加藥物在水中的溶解度。通常的做

20、法是，將高分子共聚物和藥物共溶于水中，此法對(duì)于很多水溶性差的藥物來說，會(huì)造成載藥量減少，并且由于高分子材料自身的水溶性較差，很多時(shí)候需要將兩者共同溶于有機(jī)溶劑中，然后用水透析出去。還有一種方法是形成水包油的乳劑再除去有機(jī)溶劑。這些方法都比較復(fù)雜且不經(jīng)濟(jì)。最近，有人將叔丁醇-水的系統(tǒng)引入到高聚物膠團(tuán)的制備過程中，制備了紫杉醇和多烯紫杉醇的高分子膠團(tuán)，取得較好效果。其方法是將藥物與高分子共溶制備澄明溶液，凍干后的固體分散物加水水化后即得到小于100納米的膠團(tuán)。此工藝簡(jiǎn)單、方便，效果好，并且，叔丁醇-水共溶劑還可以回收利用，增加了大量生產(chǎn)的可行性。改進(jìn)制劑工藝路線由于叔丁醇-水共溶劑體系可以將水溶性

21、和脂溶性的物質(zhì)共同溶解在一起，溶劑可以在凍干后除去。因此，可以采用此方法對(duì)很多制劑的制備工藝進(jìn)行改進(jìn)。蛋白質(zhì)肽類的口服給藥一直是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。叔丁醇-水共溶劑系統(tǒng)為水溶性的蛋白質(zhì)-多肽溶于油溶液提供了一種新的藥物傳遞辦法。研究人員采用叔丁醇-水共溶劑體系，冷凍干燥制備含有蛋白質(zhì)-多肽的磷脂分散體，將這種凍干分散體溶于油溶液中，制成包裹水溶性蛋白質(zhì)-多肽的反膠團(tuán)油溶液。為了解決難溶性藥物在水中的溶解度，通常采用環(huán)糊精包合技術(shù)。常規(guī)冷凍干燥采用乙醇為溶劑溶解難溶性藥物，由于乙醇的溶解能力有限，通常需要使用較多的溶劑，并且含乙醇的共溶劑體系不易凍結(jié)，冷凍干燥效果不好。于是，研究人員將藥物與環(huán)

22、糊精溶于叔丁醇-水共溶劑系統(tǒng)，冷凍干燥一步制備形成包合物。由于叔丁醇溶解難溶性藥物的能力強(qiáng)于乙醇，且凍結(jié)完全，干燥迅速，此方法提供了一種方便的制備環(huán)糊精包合物的新工藝。相關(guān)鏈接： 叔丁醇作為凍干劑的特點(diǎn)目前，在室溫條件下可以凍結(jié)的有機(jī)溶劑主要有4種：叔丁醇、冰醋酸、環(huán)己烷和二甲基亞砜。其中，叔丁醇被認(rèn)為是最適合制劑的凍干溶劑。其特點(diǎn)如下：1、凝固點(diǎn)高。純的叔丁醇在室溫下（25）就可以凍結(jié)，與水混合后也可以在零下幾度凍結(jié)，在現(xiàn)有的凍干機(jī)中都可以完全凍結(jié)。2、叔丁醇的蒸汽壓較高。蒸汽壓高有利于升華，節(jié)省凍干時(shí)間。3、叔丁醇與水可以任意比例混合。這一點(diǎn)極為重要，可以增大一些脂溶性藥物在水中的溶解度，

23、同時(shí)對(duì)一些水溶液中不穩(wěn)定的藥物，加入適量的叔丁醇可以抑制藥物的分解，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性。4、叔丁醇毒性低。在凍干過程中，大部分叔丁醇可在一次干燥階段升華，在制劑中殘留量很低。5、叔丁醇自身在凍結(jié)中形成針狀結(jié)晶，能改變?nèi)苜|(zhì)的結(jié)晶方式，利于升華。而當(dāng)少量的叔丁醇加入到水中形成叔丁醇-水共溶劑后，可以改變水的結(jié)晶狀態(tài)，在凍結(jié)過程中形成針狀結(jié)晶，具有大的表面積,同時(shí)冰晶升華后，留下了管狀通道，使水蒸氣流動(dòng)阻力大大減小，升華速率顯著提高，因此可用叔丁醇來加快冷凍干燥過程中的傳質(zhì)過程。6、叔丁醇作為凍干溶劑的優(yōu)點(diǎn)很多，但叔丁醇的純度以及叔丁醇作為有機(jī)溶劑的生產(chǎn)安全性和回收利用問題均需引起生產(chǎn)者注意。三、蛋白

24、質(zhì)藥品冷凍干燥技術(shù)研究1 引言    由于凍干藥品呈多孔狀、能長時(shí)間穩(wěn)定貯存、并易重新復(fù)水而恢復(fù)活性，因此冷凍干燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備固體蛋白質(zhì)藥物、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質(zhì)體等藥品。從國家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫得知，目前國內(nèi)已有注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素2b、凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素2b、凍干人凝血因子V、凍干人纖維蛋白原、間苯三酚口服凍干片等凍干藥品獲準(zhǔn)上市。截止2000年2月，美國FDA已批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥

25、共計(jì)76個(gè)。2 藥品凍干損傷和保護(hù)機(jī)理藥品冷凍干燥是一個(gè)多步驟過程，會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)力使藥品變性，如低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力和干燥應(yīng)力。其中凍結(jié)應(yīng)力又可分為枝狀冰晶的形成，離子濃度的增加，PH值的改變和相分離等情況。因此，為了保護(hù)藥品的活性，通常在藥品配方中添加活性物質(zhì)的保護(hù)劑。它需要具備四個(gè)特性：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高、吸水性差、結(jié)晶率低和不含還原基。常用的保護(hù)劑有如下幾類物質(zhì)：a) 糖類/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等；b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；c) 無水溶劑：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；d) 表面活性劑：Tween 80等；e) 氨基酸：L-

26、絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；f) 鹽和胺：磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等；由于冷凍干燥過程存在多種應(yīng)力損傷，因此保護(hù)劑保護(hù)藥品活性的機(jī)理也是不同的，可以分為低溫保護(hù)和凍干保護(hù)。 對(duì)于低溫保護(hù)，目前被廣為接受的液體狀態(tài)下蛋白質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)理之一是優(yōu)先作用原理。優(yōu)先作用是指蛋白質(zhì)優(yōu)先與水或水溶液中的保護(hù)劑作用。在有起穩(wěn)定作用的保護(hù)劑存在的條件下，蛋白質(zhì)優(yōu)先與水作用（優(yōu)先水合），而保護(hù)劑優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（優(yōu)先排斥）。在這種情況下，蛋白質(zhì)表面就比其內(nèi)部有較多的水分子和較少的保護(hù)劑分子。優(yōu)先作用原理同樣適用于冷凍-融解過程。蛋白質(zhì)保護(hù)劑，在溶液中被從蛋白質(zhì)表面排斥，在凍結(jié)過程中能夠穩(wěn)定蛋

27、白質(zhì)。但是優(yōu)先作用機(jī)理不能完全解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。在凍干過程中，由于蛋白質(zhì)的水合層被除去，優(yōu)先作用機(jī)理不再適用。對(duì)于凍干保護(hù)機(jī)理，仍在研究探討之中，目前主要有兩種：a) 水替代假說。許多研究者認(rèn)為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子聯(lián)結(jié)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過程中失去水分后，保護(hù)劑的羥基能替代蛋白質(zhì)表面的水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。b) 玻璃態(tài)假說。研究者認(rèn)為在含保護(hù)

28、劑溶液的干燥過程中，當(dāng)濃度足夠大且保護(hù)劑的結(jié)晶不會(huì)發(fā)生時(shí)，保護(hù)劑-水混合物就會(huì)玻璃化。研究發(fā)現(xiàn)在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為，粘度極高，不容易形成結(jié)晶，且分子擴(kuò)散系數(shù)很低，因而具有粘性的保護(hù)劑包圍在蛋白質(zhì)分子的周圍，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體，使大分子物質(zhì)的鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，阻止蛋白質(zhì)的伸展和沉淀，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)作用。目前大部分學(xué)者贊同"水替代假說"，因?yàn)榭梢酝ㄟ^實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到蛋白質(zhì)和保護(hù)劑之間的氫鍵，為理論提供證據(jù)。事實(shí)上，無論是"水替代假說"還是"玻璃態(tài)假說"，它們的基礎(chǔ)都是基于藥

29、液實(shí)現(xiàn)了部分或全部玻璃化凍結(jié)。4 凍干工藝及優(yōu)化由于藥品冷凍干燥過程會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)力，對(duì)凍干藥品的藥性有很大的影響，因此對(duì)藥品冷凍干燥過程進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，對(duì)于減少凍干損傷和提高凍干藥品的質(zhì)量有重大的意義。  4.1凍結(jié)研究冷凍干燥過程中的凍結(jié)過程非常重要，因?yàn)樵趦鼋Y(jié)中形成的冰晶形態(tài)和大小以及玻璃化程度不僅影響后繼的干燥速率，而且影響凍干藥品的質(zhì)量。因此在凍結(jié)過程中必須考慮配方、凍結(jié)速率、凍結(jié)方式、以及是否退火等問題。    4.1.1 配方的影響配方中的固體含量會(huì)影響凍結(jié)和干燥過程。如果固體含量少于2%，那么凍干藥品結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能就會(huì)不穩(wěn)定。尤其在干燥過程中

30、，藥品微粒不能粘在基質(zhì)上，逸出的水蒸氣會(huì)把這些微粒帶到小瓶的塞子上，有時(shí)甚至?xí)У秸婵帐耶?dāng)中。此外，為了獲得均勻一致、表面光滑、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥品，配方中必須含有填充劑、賦形劑、穩(wěn)定劑等保護(hù)劑，這些保護(hù)劑對(duì)實(shí)現(xiàn)藥品的玻璃化凍結(jié)有重大的影響。很多糖類或多元醇經(jīng)常被用于溶液凍融和凍干過程中非特定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，它們既是有效的低溫保護(hù)劑又是很好的凍干保護(hù)劑，它們對(duì)凍結(jié)的影響取決于種類和濃度。文獻(xiàn)對(duì)不同的保護(hù)劑進(jìn)行了詳盡的研究，探討了它們的凍結(jié)特性。文獻(xiàn)還研究了其它保護(hù)劑的凍結(jié)特性。但是蛋白質(zhì)種類很多，而且物理化學(xué)性質(zhì)各異，因此不同的蛋白質(zhì)需要不同的保護(hù)劑配方，因此它們的凍結(jié)特性就不同，一般需要實(shí)驗(yàn)。4

31、.1.2 凍結(jié)方式凍結(jié)方式不同，產(chǎn)生的冰晶的形態(tài)和大小就不同，而且會(huì)影響后繼的干燥速率和凍干藥品質(zhì)量。根據(jù)凍結(jié)機(jī)理，可以把凍結(jié)分為全域過冷結(jié)晶和定向結(jié)晶兩類。全域過冷結(jié)晶是指全部藥液處于相同或相近的過冷度下進(jìn)行凍結(jié)的方式。在全域過冷結(jié)晶中，凍結(jié)速率和冰晶成核溫度是重要的參數(shù)。全域過冷結(jié)晶按凍結(jié)速率的快慢可分為慢速凍結(jié)和快速凍結(jié)。快速凍結(jié)的冰晶細(xì)小，而且沒有凍結(jié)濃縮現(xiàn)象，但是存在不完全凍結(jié)現(xiàn)象。相反，慢速冷卻產(chǎn)生較大的冰晶，并且存在凍結(jié)濃縮的現(xiàn)象。Thomas W Patapoff等人發(fā)現(xiàn)如果把藥品直接浸入液氮或干冰-乙醇溶液槽中（快速凍結(jié)），那么晶核首先在瓶壁產(chǎn)生，然后冰晶向中心擴(kuò)散，再垂直向

32、上擴(kuò)散。由于長成的冰晶細(xì)小，而且有水平方向的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致干燥階段的傳質(zhì)阻力很大，升華速率降低。實(shí)驗(yàn)證明，快速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率低，解吸速率快，慢速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率快，解吸速率慢。James A Searles等人認(rèn)為冰晶成核溫度是全域過冷結(jié)晶的重要因素，因?yàn)樗巧A速率的主要決定因素。他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，冰晶成核溫度從本質(zhì)上來說是隨機(jī)的、不穩(wěn)定的，不容易控制，但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核體等影響因素。正是冰晶成核溫度的隨機(jī)性導(dǎo)致升華干燥速率的不均勻性以及與形態(tài)相關(guān)的參數(shù)，如凍干藥品表面積和解吸干燥速率。定向結(jié)晶是指一小部分藥液處于過冷狀態(tài)下進(jìn)行凍結(jié)的方式。Thomas W Patapof

33、f介紹了一種垂直凍結(jié)方式。溶液用濕冰冷卻，在瓶子底部用干冰冷卻，形成晶核，然后放到-50的擱板上凍結(jié)。用這種方式凍結(jié)的樣品的冰晶在垂直方向呈現(xiàn)煙囪狀，在藥品表面沒有凍結(jié)濃縮層，而且整個(gè)藥品的結(jié)構(gòu)均一性很好，因此在干燥時(shí)的傳質(zhì)阻力很小，加快了凍干速率。Martin Kramer等人采用了另外一種方式實(shí)現(xiàn)了定向凍結(jié)。他們?cè)谡婵帐覊毫?.1kPa，擱板溫度為+10的條件下，讓溶液開始表面凍結(jié)，形成13mm左右的冰晶薄層。然后解除真空，降低擱板溫度到結(jié)晶溫度以下進(jìn)行凍結(jié)。在這種條件下長成的冰晶粗大，也呈煙囪狀。同時(shí)在干燥階段發(fā)現(xiàn)，升華干燥時(shí)間比采用一般凍結(jié)的時(shí)間節(jié)省了20%。分析凍干藥品時(shí)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)

34、甘露醇，采用這種方式凍結(jié)的凍干品的剩余含水量比采用一般凍結(jié)的要多；但對(duì)蔗糖和甘氨酸，兩者差別不大。H Schoof等人在凍干膠原質(zhì)時(shí)也采用了定向結(jié)晶的方式。凍結(jié)方式不同，產(chǎn)生的冰晶形態(tài)和大小就不同，后繼的干燥速率也不同。實(shí)驗(yàn)證明，采用定向結(jié)晶方式的凍結(jié)藥品的干燥速率比全域過冷結(jié)晶的快。但是無論采用哪種凍結(jié)方式，藥品溶液必須部分或全部實(shí)現(xiàn)玻璃化凍結(jié)，以保護(hù)藥品藥性。    4.1.3 退火退火是指把凍結(jié)藥品溫度升到共熔溫度以下，保溫一段時(shí)間，然后再降低溫度到凍結(jié)溫度的過程。在升華干燥之前增加退火步驟，至少有三個(gè)原因：a) 強(qiáng)化結(jié)晶。在凍結(jié)過程特別是快速凍結(jié)過程中，配

35、方中結(jié)晶成分往往來不及完全結(jié)晶。但是如果該成分能為凍干藥品結(jié)構(gòu)提供必要的支撐或者蛋白質(zhì)在該成分完全結(jié)晶后會(huì)更穩(wěn)定，那么就有必要完全結(jié)晶。此外，凍結(jié)濃縮液中也會(huì)有一部分水來不及析出，使其達(dá)不到最大濃縮狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)退火的溫度高于配方的最大濃縮液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg'時(shí)，會(huì)促進(jìn)再結(jié)晶的形成使結(jié)晶成分和未凍結(jié)水結(jié)晶完全。b) 提高非晶相的最大濃縮液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg'。從非晶相中除去Tg'較低的結(jié)晶成分，能夠提高非晶相的Tg'。Barry J Aldous在研究非晶態(tài)碳水化合物的水合物結(jié)晶規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過退火之后的海藻糖干燥溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度由31上升到79，大大

36、提高了穩(wěn)定作用。c) 改變冰晶形態(tài)和大小分布，提高干燥效率。James A Searles等人研究認(rèn)為不同的成核溫度產(chǎn)生不同的冰晶形態(tài)和粒徑大小，繼而導(dǎo)致升華干燥的速率的不均勻。但是一個(gè)過程中的干燥速率是由最慢的干燥藥品確定的，因此不均勻的干燥速率會(huì)影響藥品的質(zhì)量和生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。研究證實(shí)退火過程中的相行為和重結(jié)晶可以減小由于成核溫度差異造成的冰晶尺寸差異及干燥速率的不均勻性，提高干燥效率和藥品均勻性。為了達(dá)到退火目的，在退火操作中，必須考慮加熱速率、退火溫度、退火時(shí)間等參數(shù)。但是目前由于實(shí)驗(yàn)手段不夠先進(jìn)和理論知識(shí)比較缺乏，退火機(jī)理尚有疑問，退火參數(shù)的選取仍然沒有依據(jù)。  4.2 干燥

37、藥品冷凍干燥的干燥過程可以分為兩個(gè)階段，一次干燥和二次干燥。在一次干燥階段除去自由水，在二次干燥階段除去部分結(jié)合水。干燥過程占據(jù)了藥品冷凍干燥過程的大部分能耗，因此采取有效措施提高干燥速率顯得非常有意義。目前，大都采取控制擱板和藥品溫度、冷阱溫度和真空度的做法來實(shí)現(xiàn)干燥速率的提高。藥品溫度的控制：包括凍結(jié)層和已干層的溫度控制。控制凍結(jié)層溫度的原則是在保證凍結(jié)層不發(fā)生熔化（在低共熔點(diǎn)以下）的前提下，溫度越高越好。控制已干層溫度的原則是在不使物料變性或已干層結(jié)構(gòu)崩塌的前提下、盡量采用較高的干燥溫度。而擱板溫度的控制是以滿足藥品溫度控制為標(biāo)準(zhǔn)。冷阱溫度：凍干過程中水升華的驅(qū)動(dòng)力是藥品和冷阱間的溫差。

38、由于藥品溫度受加熱方式的限制，同時(shí)不能高于共熔溫度，因此冷阱溫度越低越好。為了提高經(jīng)濟(jì)性，在升華干燥過程中應(yīng)至少低于藥品溫度20；在解吸干燥過程中，對(duì)于那些要求很低殘余水分的配方，冷阱溫度要求更低。真空度：一般認(rèn)為，壓力對(duì)凍干過程有正反兩方面的影響：a) 在藥品共熔點(diǎn)溫度和崩塌溫度以下，升華界面溫度越高，升華水汽越多，所需熱量越大。壓力越高，相應(yīng)提高了已干層導(dǎo)熱系數(shù)，表面對(duì)流作用也越大，因此升華水汽也越快，即凍干速率越大。b) 升華界面通過已干層到外部的水汽逸出速度與界面和表面之間的壓力差，即界面溫度所對(duì)應(yīng)的飽和壓力與干燥室的真空度之差相關(guān)。這個(gè)壓差大，有助于水汽逸出。這個(gè)壓差越小，逸出越慢，

39、干燥速率也越小。如果冷凍干燥是傳熱控制過程，則干燥速率隨著干燥室壓力升高而提高；如果冷凍干燥是傳質(zhì)控制過程，干燥速率隨著干燥室壓力升高而降低。經(jīng)驗(yàn)證明升華階段的真空度在1030Pa時(shí)，既有利于熱量的傳遞，又利于升華的進(jìn)行。若壓強(qiáng)過低，則對(duì)傳熱不利，藥品不易獲得熱量，升華速率反而降低，而且對(duì)設(shè)備的要求也更高，增加了成本。而當(dāng)壓強(qiáng)過高時(shí)，藥品內(nèi)冰的升華速度減慢，藥品吸收熱量將減少，于是藥品自身的溫度上升，當(dāng)高于共熔點(diǎn)溫度時(shí)，藥品將發(fā)生熔化導(dǎo)致凍干失敗。根據(jù)真空度對(duì)凍干速率的影響，文獻(xiàn)采用了循環(huán)壓力法，得到了不錯(cuò)的效果。藥品冷凍干燥過程是一個(gè)連續(xù)的操作，不同的藥品配方，有不同的凍結(jié)特性，而且凍干曲線

40、也不同，因此應(yīng)在基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上廣泛開展個(gè)體研究，優(yōu)化凍干曲線，提高干燥速率，降低能耗。耐熱凍干保護(hù)劑在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用研究?jī)龈杀Ｗo(hù)劑可影響生物制品的質(zhì)量、效價(jià)和穩(wěn)定性，改變生物制品的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品干燥能力并增大產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性。耐熱凍干保護(hù)劑有免疫活性但無藥理活性，可在凍干和保存時(shí)維持疫苗的穩(wěn)定性，初次干燥時(shí)在適宜的溫度下疫苗不倒塌，企業(yè)低成本即可獲取。一、分類 （一）按相對(duì)分子量分 按相對(duì)分子量分可分為低分子化合物和高分子化合物。 1.低分子化合物 低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水分緩解作用。如： 酸性物質(zhì)：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸； 中性物質(zhì)：葡萄糖、乳糖、蔗糖、

41、海藻糖、山梨醇； 堿性物質(zhì)：精氨酸、組氨酸。 2.高分子化合物 高分子化合物對(duì)微生物有保護(hù)作用，可促進(jìn)其升華形成耐熱骨架阻斷熱傳導(dǎo)和熱輻射。如：白蛋白、明膠、蛋白胨、脫脂奶粉。 水解明膠 水解明膠可去掉雜質(zhì)蛋白、無抗原性、無過敏反應(yīng)、無熱源，并且分子量小、均質(zhì)、易溶于水，可過濾除菌，共熔點(diǎn)為-12。對(duì)微生物的保護(hù)作用高出普通明膠10以上。脫脂奶粉 可促進(jìn)升華、加熱滅菌，易取得均質(zhì)產(chǎn)品，并擴(kuò)大細(xì)胞相互間的距離。 (二)按功能和性質(zhì)分1.耐熱凍干保護(hù)劑 耐熱凍干保護(hù)劑在凍結(jié)和干燥過程中，可防止活性組分變性，如海藻糖、蔗糖、聚維酮（PVP）等。2.填充劑 可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，如：甘露

42、醇、明膠等。3.抗氧化劑 產(chǎn)品的自身氧化可消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧；放入電子或氫離子，可阻斷凍干樣品中氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制氧化酶活性，防止樣品在冷凍干燥及儲(chǔ)藏過程中氧化變質(zhì)。如硫代硫酸鈉、維生素E、維生素C等。4.酸堿調(diào)整劑 在冷凍干燥、儲(chǔ)藏過程中，將生物制品PH值調(diào)整到活性物質(zhì)最穩(wěn)定區(qū)域。常用的有：磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉。（三）按物質(zhì)的種類分1.糖/多元醇類 單糖（葡萄糖、半乳糖）： 糖與生物制品活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，起保護(hù)作用；低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低溫保護(hù)功能和脫水保護(hù)作用；海藻糖則具有相對(duì)較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。海藻糖蛋白質(zhì)水微冰晶的形成，有效防止了水

43、對(duì)玻璃化態(tài)的增塑作用。并且其內(nèi)部氫鍵較少，有利于蛋白質(zhì)分子間形成氫鍵。多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）:多元醇具有和糖一樣的作用。甘露醇無菌濾液穩(wěn)定，不易被氧化，可提供支持結(jié)構(gòu)，并且不與活性組分發(fā)生反應(yīng)；山梨醇是甘露醇的同分異構(gòu)體，但其溶解度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠的透明狀液體，有旋光性，略有甜味，具有吸濕性，高溫下不穩(wěn)定，在冷凍干燥配方中，山梨醇常用作填充劑。2.表面活性劑類 表面活性劑是降低界面的張力，親水、親油基組成的化合物。表面活性劑可分為離子型、非離子型。凡是溶于水能電離成離子的，稱為離子型表面活性劑，否則稱為非離子型表面活性劑。表面活性劑在凍結(jié)和脫水過程中既能降低冰、水界面張力所

44、引起的凍結(jié)和脫水變形，又能在復(fù)水過程中對(duì)活性組分起到潤濕劑作用。但在凍干生物制品測(cè)定和長期儲(chǔ)藏中，表面活性劑并沒有保護(hù)作用。3.氨基酸類 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，其中最主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸類保護(hù)劑有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和組氨酸，試驗(yàn)表明氨基酸是最好的填充劑。低濃度甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致PH值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性，并且能升高成品的塌陷（崩解）溫度，阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。4.其它添加劑類 其它添加劑類保護(hù)劑包括抗氧化劑、緩沖劑和凍干加速劑。抗氧化劑：一種是抗氧化劑的自身氧化，消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧，使凍干樣品物料不被

45、氧化；另一種使抗氧化劑給出電子或氫離子，阻斷凍干樣品中的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；還有一種方式是抗氧化劑通過抑制氧化的活性而防止凍干樣品的氧化變質(zhì)，如維生素E、維生素C、硫代硫酸鈉、硫脲。緩沖劑：蛋白質(zhì)具有兩性電解質(zhì)，既能和酸作用又能和堿作用。在中性環(huán)境中，大多數(shù)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，由于蛋白質(zhì)溶液在凍結(jié)過程中溶液的濃度是逐漸升高的，所以在高濃度時(shí)可改變?nèi)芤旱腜H值，PH值變化4個(gè)單位導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使生物制品失活。因此在凍干保護(hù)劑配方中，需添加適量緩沖劑。如，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉。凍干加速劑：冷凍干燥過程耗時(shí)長、耗能多，迫切需要對(duì)凍干循環(huán)進(jìn)行優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本。叔丁醇是一種小分子醇，與水完全互溶，具有低毒性

46、、高蒸汽壓。在藥品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：可降低干燥層阻力，從而加速干燥過程，縮短干燥時(shí)間；對(duì)于難溶于水的藥品，可使產(chǎn)品具有較高的比表面積、好的外觀，并易于復(fù)水，提高藥品溶液和凍干品的穩(wěn)定性，且有一定的抑菌作用。二、凍干保護(hù)劑的作用機(jī)理（一）凍結(jié)過程中低溫保護(hù)機(jī)理“優(yōu)先作用”機(jī)理認(rèn)為，蛋白質(zhì)溶液在達(dá)到最大凍結(jié)濃度之前，優(yōu)先與水作用（優(yōu)先水合），而保護(hù)劑優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（優(yōu)先排斥）。這是由于保護(hù)劑的加入，增大了水分子的表面張力，促使了蛋白質(zhì)分子優(yōu)先與水分子相互作用。在這種情況下，蛋白質(zhì)分子外表面比其體相中有相對(duì)較多的水分子和相對(duì)較少的保護(hù)劑分子，從而也就保護(hù)了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。

47、“優(yōu)先作用”機(jī)理并不能完全解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。因此，必然存在其他保護(hù)作用機(jī)理。表面張力減小的機(jī)理可以用于解釋表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)溶液凍結(jié)過程的保護(hù)。限制蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散的機(jī)理認(rèn)為，許多保護(hù)劑都能夠提高溶液的粘度，抑制活性分子的擴(kuò)散。（二）干燥過程中的保護(hù)機(jī)理玻璃態(tài)假說 在含有保護(hù)劑溶液的干燥過程中，當(dāng)濃度足夠大且保護(hù)劑不發(fā)生結(jié)晶時(shí)，保護(hù)劑與活性組分混合物就會(huì)形成玻璃態(tài)。玻璃態(tài)分為兩種即：強(qiáng)玻璃和弱玻璃。在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下進(jìn)行降溫，弱玻璃粘度的增加，比強(qiáng)玻璃來的快。因此，賦形劑形成弱玻璃要比形成強(qiáng)玻璃的保護(hù)效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因?yàn)槟軌蛐纬梢环N弱玻璃而具有很好

48、的保護(hù)作用。水替代假說 由于蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過程中推動(dòng)水分后，保護(hù)劑的羥基能夠替代蛋白質(zhì)表面上水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層“水合層”，這樣就可以保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，從而保持了蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和功能的完整性。當(dāng)冷凍干燥時(shí)，保護(hù)劑可與生物大分子的失水部位形成氫鍵，替代保持生物大分子凍干損傷。（三）儲(chǔ)藏過程中的保護(hù)機(jī)理 干燥過程中出現(xiàn)的引起蛋白質(zhì)變質(zhì)的時(shí)間尺度為小時(shí)，而對(duì)于儲(chǔ)藏而言，時(shí)間尺度為月或年。在正確的冷凍干燥工藝中，要求產(chǎn)品溫度接近于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而在正確的儲(chǔ)藏條件下，環(huán)境溫度應(yīng)當(dāng)比其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低得多

49、，以獲得很長的松馳時(shí)間。三、耐熱凍干保護(hù)劑配方需要注意的問題 確定最優(yōu)的pH值 生物制品中的活性成分（如蛋白質(zhì)）只有在很小的PH值范圍內(nèi)才是穩(wěn)定的，并且不同的PH環(huán)境會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性。最優(yōu)的PH環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和它在溶液中的溶解性，冷凍干燥配方的PH對(duì)凍干生物制品長期儲(chǔ)藏的穩(wěn)定性也會(huì)帶來很大影響。另外，酸堿度會(huì)影響固體狀態(tài)下蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性。緩沖劑的選擇 許多緩沖劑能夠用于生物制品耐熱保護(hù)劑配方中，但是并非每一種緩沖劑都能夠用于任何溶液；對(duì)PH值敏感的蛋白質(zhì)溶液，就應(yīng)當(dāng)避免使用磷酸鈉緩沖液，這是由于在凍結(jié)過程中，Na2HPO4易于優(yōu)先結(jié)晶，使得溶液的PH降低，最終引起蛋白

50、質(zhì)變性；正確選擇緩沖劑的濃度也是很重要的。填充劑的選擇 填充劑有相當(dāng)好的溶解性，與生物制品中活性組分相容，沒有或者只有很小的毒性，具有較高的共晶溫度。低溫、干燥保護(hù)劑的選擇 糖類是生物制品冷凍干燥過程中使用最頻繁的保護(hù)劑，一般不選用還原性糖，因?yàn)樗赡芘c蛋白質(zhì)之間發(fā)生非酶褐變反應(yīng)；某些鹽類也要用作生物制品在冷凍干燥過程中的保護(hù)劑；某些聚合物，因其能提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而常被用作保護(hù)劑。但是，聚合物與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于糖類，所以常常采用聚合物和糖聯(lián)合使用，當(dāng)然，這種方式并不是對(duì)每一種蛋白質(zhì)都是有效的。超濾技術(shù)應(yīng)用于穿琥寧凍干粉針的研究【關(guān)鍵詞】 超濾技術(shù) 【摘要】 目的 提高穿琥寧

51、凍干粉針質(zhì)量。方法采用“高純度穿琥寧生產(chǎn)工藝”專利超濾技術(shù)生產(chǎn)穿琥寧凍干粉針并與其它廠家同類產(chǎn)品進(jìn)行動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)比較。結(jié)果超濾技術(shù)生產(chǎn)的注射用穿琥寧ld50 明顯高于其它廠家生產(chǎn)的同規(guī)格產(chǎn)品，單次靜脈給藥的ld50 達(dá)到910mg/kg，而國家標(biāo)準(zhǔn)說明書中的ld50 為675mg/kg，文獻(xiàn)資料報(bào)道穿琥寧注射劑的單次靜脈給藥的ld50 為580620mg/kg。結(jié)論超濾技術(shù)可以大大降低注射用穿琥寧產(chǎn)品的毒性，提高臨床安全性。注射用穿琥寧是采用爵床科植物穿心蓮提取物穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)酯化、脫水、成鹽而制成的脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽，加入ph調(diào)節(jié)劑、碳酸氫鈉等藥用輔料經(jīng)冷凍干燥而制成的供肌肉注

52、射或靜脈滴注用的無菌凍干粉針。用于病毒性肺炎、病毒性上呼吸道感染等。穿心蓮性寒、味苦，能清熱解毒，消炎止痛。可用于急性細(xì)菌性痢疾、急性胃腸炎、扁桃體炎、咽喉炎等。我國科研工作者于70年代初對(duì)穿心蓮提取物成分進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明，有效成分為其二萜類內(nèi)酯化合物。因二萜類內(nèi)酯化合物均難溶于水，無法滿足臨床需要，通過在內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中引入不同的親水基團(tuán)，增加內(nèi)酯的水溶性，目前已制成了多種穿心蓮內(nèi)酯針劑，穿琥寧即是抗炎解熱作用最強(qiáng)者，目前在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，1992年被國家中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)為全國中醫(yī)院急診科（室）首批必備中藥之一。我們通過北京圖書館對(duì)近年在醫(yī)藥刊物發(fā)表的有關(guān)穿琥寧86 篇論文進(jìn)行分析，

53、在24篇專題報(bào)道不良反應(yīng)的文章中，除1篇只寫“使用穿琥寧”外，其余23篇所報(bào)道的全部是水針劑。專家認(rèn)為:穿琥寧水針劑不穩(wěn)定，在室溫條件下有效期為30.5天，因穿琥寧為一個(gè)二萜類內(nèi)酯化合物，而且分子中有一共軛雙鍵，因而化學(xué)活性高，易發(fā)生水解反應(yīng)和氧化反應(yīng)，生產(chǎn)中還要進(jìn)行高溫滅菌，這又促進(jìn)了分解反應(yīng)。純凈穿琥寧水溶液微黃略顯綠色，但國內(nèi)市場(chǎng)上穿琥寧水針劑的色澤深，有的甚至變成了黃色或棕黃色。穿琥寧水針劑的毒副反應(yīng)主要為嬰幼兒泄瀉，發(fā)生率為22%;個(gè)別有白細(xì)胞銳減、過敏性休克、藥疹、抽搐、瘙癢、高熱、寒顫、呼吸困難、紫癜等。為了提高穿琥寧凍干粉針劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)研究了“高純度穿琥寧生產(chǎn)工藝”專利超濾技術(shù)，應(yīng)用于該產(chǎn)品生產(chǎn)并與其它廠家同類產(chǎn)品進(jìn)行的動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)情況。1 生產(chǎn)工藝1.1 儀器 88-2型切向流超濾器，cl-25蠕動(dòng)泵（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）;millipore超濾膜堆（截留分子量:5000）;lgj5型冷凍干燥機(jī);西林瓶洗、烘、灌聯(lián)動(dòng)生產(chǎn)線。1.2 藥品與試劑穿琥寧（注射級(jí)，成都天臺(tái)山制藥有限公司）;碳酸氫鈉（注射級(jí)，上海虹光化工廠）;右旋糖酐4