1、 微生物的計數(shù)血球計數(shù)板法【摘要】測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，有分光光度法、顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。分光光度法比較簡便，易操作，但是會使數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏大。而平板計數(shù)法則會使實驗數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏小。 顯微計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。本實驗采用血球計數(shù)板法，主要目的是了解血球計數(shù)板法的構(gòu)造和使用方法，學(xué)會用血球計數(shù)板對酵母菌

2、細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。一、實驗?zāi)康呐c要求 1、了解微生物計數(shù)常用的三種方法：分光光度法；平板計數(shù)法；血球計數(shù)板法。2、了解血球計數(shù)板的構(gòu)造和使用方法。3、學(xué)會用血球計數(shù)板對酵母細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。二、基本原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（0.1mm2），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。血球計數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽

3、構(gòu)成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室，微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進(jìn)行。 計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即1625=400小方格。 每一個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為01mm，所以計數(shù)室的容積為01mm3。在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方

4、格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個大方格有25個中方格的計數(shù)板為例進(jìn)行計算：設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3=1000mm3， =50000AB（個）同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，設(shè)五個中方格的總菌數(shù)為A，則三、實驗材料1）菌種：釀酒酵母菌2）用品：顯微鏡、血球計數(shù)板、酒精燈、蓋玻片、接種環(huán)、番紅染液、膠頭滴管。四、實驗方法 1、實驗流程圖 制備稀釋液加樣找計數(shù)室計數(shù)2、實驗步驟1）鏡檢計數(shù)室：在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計數(shù)。

5、2）將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。 3)取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。然后在顯微鏡下找到計數(shù)室。若計數(shù)室沾有雜質(zhì)或者菌體，要用蒸餾水沖洗計數(shù)板，用濾紙吸干其上的水分。然后再放到顯微鏡下找到計數(shù)室。 4)將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。 5)靜置片刻，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。 6)計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組

6、成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。本實驗采用25格16格的血球計數(shù)板。計數(shù)時應(yīng)數(shù)5個大方格。 7)計數(shù)。每個樣品重復(fù)計數(shù)23次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），求出每一個小格中細(xì)胞平均數(shù)（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。 8)測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入

7、盒保存。 9）計算結(jié)果。 可用以下公式進(jìn)行計算（1）16格25格的血球計數(shù)板計算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=100小格細(xì)胞個數(shù)/10040010000稀釋倍數(shù)（2）25格16格的血球計數(shù)板計算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=80小格細(xì)胞個數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)5、 實驗結(jié)果計算次數(shù)各大格中細(xì)胞數(shù)大格中細(xì)胞總數(shù)稀釋倍數(shù)總菌數(shù)（CFU/mL或g)左上右上左下右下中間第一次3237403944960100960000000六、結(jié)論與分析1、誤差來源本次試驗中我們組用的是2號酵母培養(yǎng)液，是本次試驗所用的酵母培養(yǎng)液中濃度最高的培養(yǎng)液。但是經(jīng)過老師分析，實驗數(shù)據(jù)仍然偏大的一點。產(chǎn)生這種誤差的原因大概如下：酵母細(xì)胞計

8、數(shù)的誤差分別來源于技術(shù)誤差和固有誤差。其中由于操作人員不注意細(xì)節(jié)，器材處理、使用不當(dāng)，稀釋不準(zhǔn)確，細(xì)胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術(shù)誤差；而由于儀器（計數(shù)板、蓋片、吸管等）不夠準(zhǔn)確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來的細(xì)胞計數(shù)誤差屬于分布誤差或計數(shù)域誤差（filederror）。由于時間的關(guān)系，實驗計數(shù)的次數(shù)太少，難以得到準(zhǔn)確均勻的實驗數(shù)據(jù)。在實驗過程中，操作人員也存在一定的不嚴(yán)謹(jǐn)性，導(dǎo)致實驗結(jié)果產(chǎn)生誤差。由于沒有足夠多的平行數(shù)據(jù)，難以用科學(xué)的計數(shù)方法進(jìn)行結(jié)果的計算，因此難以得到比較準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)。 因此，搞好酵母細(xì)胞計數(shù)的質(zhì)量控制一般需采用以下措施。1）避免技術(shù)誤差，糾

9、正儀器誤差所用器材均應(yīng)清潔干燥，計數(shù)板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正。嚴(yán)格操作，從消毒、稀釋、加樣到計數(shù)都應(yīng)規(guī)，尤其應(yīng)注意的是樣品稀釋要作到充分混勻。必須一次性充滿計數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過計數(shù)室臺面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。2）縮小計數(shù)域誤差或分布誤差由于血細(xì)胞在充入計數(shù)室后呈隨機(jī)分布或，而我們所能計數(shù)的細(xì)胞分布圍是有限的，由此造成的計數(shù)誤差稱為計數(shù)域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是盡量擴(kuò)大細(xì)胞計數(shù)圍和計數(shù)數(shù)目，一般先進(jìn)行誤差估計，然后決定所需計數(shù)的數(shù)目和計數(shù)圍，只要能將誤差控制在允許圍即可。2、不足之處 血球計數(shù)板在顯微鏡下直接進(jìn)行測定。它觀察在一定的容積中的微生物的個體數(shù)目，然后推算出含菌數(shù)，簡便快捷。但是在計數(shù)時包括死活細(xì)胞均被計算在，還有微小雜物也被計算在。這樣得出結(jié)果往往偏高，因此適用于對形態(tài)個體較大的菌體或孢子進(jìn)行計數(shù)。7、 思考題1、試述血球計數(shù)板的計數(shù)原理。為什么用兩種規(guī)格不同的計數(shù)板計數(shù)同一樣品，結(jié)果是一樣的？ 答：每塊計數(shù)板由H形凹槽分為2個同樣的計數(shù)池 計數(shù)池兩側(cè)各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.10mm的計數(shù)池。計數(shù)池畫有長、寬各3.0mm的方格，分為9個大方格，每個大格面積為1.0mm;.容積為0.1mm，中央大方格用雙線分成25個中方格，位于正中及四角5個中方格是紅細(xì)胞