1、Bmi1 間充質干細胞過表達介導PTHrP胞內分泌在調節骨骼生長發育中的作用Bmi1 基因屬于 Polycomb 基因家族成員 , 能抑制細胞周期素依賴性激酶抑制因子 p16ink4a 和 p19arf, 其與造血、神經、白血病和骨髓間充質干細胞等的自增殖有關。為了探討Bmi1 間充質干細胞過表達在調節骨骼生長發育中的作用 , 我們構建了 Bmi1 間充質干細胞過表達小鼠模型(Bmi1Tg) 。我們選取了 8 周齡同窩 WT和 Bmi1Tg小鼠 , 利用組織學、 組織化學、免疫組織化學、 Real time RT-PCR 、Western blot和骨髓間充質干細胞培養等方法比較分析了WT和

2、Bmi1Tg小鼠的表型差異。比較分析發現相較于同窩 WT小鼠 ,Bmi1Tg 小鼠長骨、肝、腦、腸、肺和腎等組織以及 BM-MSCs中 Bmi1 的 RNA和蛋白表達水平明顯增高, 且體型大小、體重、長骨大小和重量、生長板寬度、骨密度、小梁骨容量/ 組織容量（ BV/TV）、骨骺、皮質骨容量及小梁骨數量、 成骨細胞數、堿性磷酸酶（ ALP）和 I 型膠原陽性面積、成骨相關基因包括Runx2、 ALP、COL-I、和骨鈣素（ OCN）的表達水平、 BM-MSCs的總成纖維細胞集落形成（CFU-f）和 ALP陽性 CFU-f 數量顯著增加。而 Bmi1Tg小鼠的骨小梁分離度和 TRAP陽性破骨細胞

3、面相較于WT小鼠明顯降低。 這些結果說明我們成功建立了Bmi1 間充質干細胞過表達的轉基因小鼠模型 , 并且 Bmi1間充質干細胞過表達能夠通過促進BM-MSCs增殖和向成骨細胞分化 , 同時抑制破骨細胞骨吸收, 從而發揮促進骨骼生長發育的作用。先前研究表明 Bmi1 缺失通過抑制骨髓間充質干細胞的增殖和向成骨細胞分化導致骨骼生長阻滯和骨質疏松表型。為了明確Bmi1 間充質干細胞過表達是否能夠糾正 Bmi1 缺失引起的生長阻滯和骨質疏松表型, 我們構建了 Bmi1 間充質干細胞過表達的 Bmi1-/-(Bmi1TggBmi1-/-)小鼠 , 運用影像學、組織化學、免疫組織化學和骨髓間充質干細胞

4、培養等方法比較分析它們與同窩WT、Bmi1Tg和 Bmi1-/- 小鼠的表型差異。結果顯示 :Bmi1 骨髓間充質干細胞過表達雖然不能完全糾正Bmi1-/- 小鼠的表型 , 但可以延長其生存期、 增加其體型和體重 , 并增加其長骨大小、重量、長度和生長板寬度。骨密度、小梁骨骨容量/ 組織容量百分率、骨骺、皮質骨容量、骨小梁數目、成骨細胞數、ALP和COL-I 陽性面積百分比以及 BM-MSCs的總成纖維細胞集落形成（CFU-f）和 ALP陽性 CFU-f 數量在Bmi1TgBmi1-/- 小鼠中明顯增加 , 而 TRAP陽性破骨細胞面在 Bmi1TgBmi1-/- 小鼠明顯減少。這些結果說明

5、Bmi1 在間充質干細胞過表達能夠通過其直接作用促進BM-MSC增殖和向成骨細胞分化 , 抑制破骨細胞骨吸收 , 發揮促進骨骼生長發育的作用; 同時也說明 Bmi1 在其它組織中的表達能夠通過其間接作用改善造骨微環境, 發揮其在調節骨骼生長發育中的作用。先前我們利用基因工程的方法, 在小鼠甲狀旁腺素相關肽基因第84 位氨基酸序列后敲入一個氨基酸翻譯終止密碼子TGA,使其只表 1-84 位, 而缺乏 NLS和 C-末端 , 建立了一個缺失PTHrPNLS和 C-末端小鼠模型 , 稱為 PTHrP Knock-In （ PTHrP KI）小鼠。PTHrP KI 小鼠表現為嚴重的生長阻滯和成熟前衰老

6、以及骨質疏松表型。然而 ,PTHrP NLS和 C-末端在調節骨骼發育和成骨細胞骨形成中的作用及機制尚不明確。我們發現在 PTHrP KI 小鼠體中 Bmi1 表達水平下調 , 因而我們推測 Bmi1 和PTHrP共定位于細胞核且存在相互作用, 為了明確 Bmi1間充質干細胞過表達是否能夠糾正 PTHrP NLS和 C 末端缺失引起的成熟前衰老和骨質疏松, 我們構建了Bmi1間充質干細胞過表達的PTHrPKI(Bmi1TgKI) 小鼠 , 運用影像學、分子生物學、組織化學、免疫組織化學和骨髓間充質干細胞培養等方法, 比較分析了它們與同窩WT、Bmi1Tg和 PTHrP KI 小鼠的表型差異。結

7、果發現 :Bmi1 間充質干細胞過表達雖然不能完全糾正PTHrP KI 小鼠的表型 , 但可以延長其生存期、增加其體型和體重, 并增加其長骨大小、長度和生長板寬度。骨密度、小梁骨骨容量 / 組織容量百分率、 骨骺、皮質骨容量、骨小梁數目、成骨細胞數、 ALP和 COL-I 陽性面積百分比以及BM-MSCs的總成纖維細胞集落形成（ CFU-f）和 ALP陽性 CFU-f 數量在 Bmi1TgKI 小鼠中明顯增加。Bmi1TgKI 小鼠中成骨相關基因包括Runx2、ALP、COL-I 和骨鈣素（ OCN）表達水平 , 抗氧化酶相關基因包括SOD1/2、谷胱甘肽還原酶（ GSR）和谷胱甘肽過氧化物酶

8、 1（GPX1）、硫氧還蛋白（ Txn1）和過氧化物酶（ CAT）以及 SOD1和Bmi1 蛋白表達水平較PTHrP KI 小鼠均明顯上調。而相較于 PTHrP KI 小鼠 , 骨小梁分離度、 TRAP陽性破骨細胞面、 RANKL與OPG比值以及破骨相關基因包括TRAP和 RANKL表達水平、細胞增殖和凋亡相關基因包括 p16、p19、p21、p27 和 p53mRNA以及 p16、p19、p21、p53 和 Caspase-3蛋白表達水平在Bmi1TgBmi1-/- 小鼠均明顯減少。此外 ,Bmi1TgKI 小鼠的細胞增殖核抗原（ PCNA）和抗凋亡蛋白 Bcl-2的蛋白表達水平相較于PTHrP KI 小鼠明顯上調。這些結果說明 Bmi1間充質干細胞過表達能夠通過抑制p16 和 p19 信號通路 ,促進骨髓間充質干細胞增殖和分化及成骨細胞骨形成, 抑制破骨細胞骨吸收、氧化應激和細胞凋亡 , 從而發揮促進骨骼生長發育的作用, 發揮改善 PTHrP KI 引起的成熟前衰老和骨質疏松的作用。本研究率先建立了Bmi1 間充質干細胞過表達的轉基因小鼠模型 , 該模型是一個研究Bmi1 在調節骨骼生長發育中的作用及機制的重要動物模型。我們的結果表明 ,Bmi1 作為 PTHrP核定位序列的下游靶標構成PTHrP-Bmi1信號軸通過抑制p16 和 p19 信號