1、酶動(dòng)力學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)（一）堿性磷酸酶Km值的測(cè)定【目的要求】1.了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2.了解米氏方程、Km值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求Km值的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】1、堿性磷酸酶：堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中，其中以肝臟為最多。其次為腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。本實(shí)驗(yàn)用的堿性磷酸酶是從大腸桿菌中提取的。2、米氏方程：Michaelis-Menten 在研究底物濃度與酶促反應(yīng)速度的定量關(guān)系時(shí)，導(dǎo)出了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的基本公式，即： (1)式中：v表示酶促反應(yīng)速度， 表示酶促反應(yīng)最大速度， S表示底物濃度， 表示米氏常數(shù)。3、 值的測(cè)定主要采用圖解法

2、，有以下四種： 雙曲線作圖法（圖1-1，a）根據(jù)公式（1），以v對(duì)s作圖，此時(shí)1/2時(shí)的底物濃度s值即為Km值，以克分子濃度（M）表示。這種方法實(shí)際上很少采用，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)條件下的底物濃度很難使酶達(dá)到飽和。實(shí)測(cè)一個(gè)近似值，因而1/2不精確。此外由于v對(duì)S的關(guān)系呈雙曲線，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)要求較多，且不易繪制。 Lineweaver- Burk作圖法雙倒數(shù)作圖法（圖1-1，b）實(shí)際工作中，常將米氏方程（式（1）作數(shù)學(xué)變換，使之成為直線形式，測(cè)定要方便、精確得多。其中之一即取（1）式的倒數(shù)，變換為L(zhǎng)ineweaver- Burk方程式： (2)以對(duì)作圖，即為y=ax+b形式。此時(shí)斜率為，縱截距為。把直線外推與

3、橫軸相交，其截距相交，其截距即為。 Hofstee作圖法（略）把（2）式等號(hào)兩邊乘以，得： (3)以v對(duì)作圖，這時(shí)斜率為，縱截距為，橫截距為。Hanas作圖法（略）把（2）式等號(hào)兩邊乘以S,得： (4)以對(duì)s作圖，這時(shí)斜率為，縱截距為。 （a） (b)本實(shí)驗(yàn)主要以雙倒數(shù)法，即Lineweaver- Burk作圖法來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶Km值。具體原理如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物，堿性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，在適宜條件下（PH10.0，和60），準(zhǔn)確反應(yīng)13分鐘。在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍(lán)色化合物，以波長(zhǎng)620nm比色。在一定條件下色澤深淺與光密度成正比。反應(yīng)式

4、如下： 然后以光密度直接表示不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速度，即以光密度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver- Burk作圖法來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶Km值。【儀器與試劑】?jī)x器：1. 恒溫水浴2. 721型分光光度計(jì)試劑：1 酚試劑：稱鎢酸鈉（W·2O）100g，鉬酸鈉（Mo·2O）25g置1500mL磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開(kāi)口煮沸15min，以除去多余的溴。

5、冷卻后定容至1000mL，過(guò)濾即成，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。若此貯存液使用過(guò)久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。使用時(shí)用蒸餾水稀釋一倍，最后酸度為1N。2 2.5mM磷酸苯二鈉基質(zhì)液：稱取625mg磷酸苯二鈉（C6H5PO4Na22H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，加數(shù)滴夜溴以防腐，置冰箱內(nèi)可保存一年之久。3 堿性緩沖液（pH10.0）： 稱取無(wú)水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g，溶解于蒸餾水中，并稀釋至1,000ml.4 堿性磷酸酶液：稱取堿性磷酸酶1mg,加水34ml，冰箱內(nèi)可保存五周左右。【實(shí)驗(yàn)步

6、驟】取6支試管按下表加入試劑：1234562.5mM磷酸苯二鈉（ml）0.20.40.60.81.01.0蒸餾水（ml）0.80.60.40.2-0.1堿性緩沖液（ml）1.01.01.01.01.01.0混勻后，60欲溫5分鐘堿性磷酸酶液（ml）0.10.10.10.10.1-混勻后，60水浴13分鐘（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）注意：1）加入堿性磷酸酶液要快速、準(zhǔn)確。用移液槍加2）此時(shí)為酶促反應(yīng)，總體積2.1ml3）第六管不加酶。酚試劑（ml）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(ml)3.03.03.03.03.03.0混勻后，室溫放置15分鐘注意：1）酚試劑為顯色劑，同時(shí)為酶的變性劑，

7、故加入酚試劑后酶促反應(yīng)即停止。2）Na2CO3 提供堿性環(huán)境，加入Na2CO3 后試劑才顯色以6管為調(diào)零點(diǎn)，在620nm波長(zhǎng)處比色。【結(jié)果處理】1 將各管光密度和底物濃度記入下表管號(hào)O.D1/O.DS1/S123452以1/O.D為縱坐標(biāo)，1/s為橫坐標(biāo)，按Lineweaver- Burk作圖，求出堿性磷酸酶的Km值。【注意事項(xiàng)】1） 加入堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確2） 保溫時(shí)間要準(zhǔn)確 準(zhǔn)確保溫的方法：從第一管加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔1分鐘向下一只試管加酶液,直至加完，到準(zhǔn)確13分鐘立即向第一管加酚試劑，以終止其反應(yīng)，并每隔1分鐘向下一只試管加酚試劑,直至加完止，這樣保證每管準(zhǔn)確保溫13分鐘。【思考題

8、】1） Km 的意義及其影響因子2） 為什么酶促反應(yīng)速度以初速度表示3） 為什么O.D可直接代替V作圖4） 分析自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)（二）溫度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解溫度對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。【實(shí)驗(yàn)原理】 每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。一般而言，若酶處于過(guò)高的溫度環(huán)境中，會(huì)使酶活性永久喪失；而若處于極低溫度的環(huán)境中只會(huì)使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會(huì)全部或部分的恢復(fù)其活性。【儀器與試劑】?jī)x器：1冰箱 2.恒溫水浴鍋 3.試管和試管架4吸量管及吸量管架 5.移液槍及槍頭 6.膠頭滴管7燒杯試劑：1PH6.8的緩沖液：量取15.45m

9、l的0.2M磷酸氫二鈉和4.55ml的檸檬酸混合搖勻即可。20.5%淀粉的0.5%氯化鈉溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化鈉，溶于100ml蒸餾水（需加熱）。3003175g/L碘液41M HCl溶液 5.1M NaOH溶液 6.稀釋100倍的唾液 7.冰水浴【實(shí)驗(yàn)步驟】1制管和預(yù)溫由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)恒溫反應(yīng)要求較高，故每個(gè)溫度梯度使用兩支試管，分別標(biāo)記為A管和B管，同時(shí)欲溫底物與酶。A管加入PH6.8的緩沖液和0.5%淀粉液；B管使用移液槍加入稀釋100倍的唾液，相對(duì)應(yīng)的兩支試管置于設(shè)定的溫度下預(yù)溫5min。取12支潔凈試管，參照下表加入試劑：管號(hào)1（0）2（室溫）3（37）4（50）5（70

10、）6（室溫）APH6.8的緩沖液（ml）222222含NaCl的0.5%淀粉液（ml）22222用2ml的蒸餾水代替B稀釋100倍的唾液（ml）111111*6號(hào)管為對(duì)照組（比色時(shí)作為0號(hào)管），置于室溫，且淀粉液用蒸餾水代替2混合A、B管將1號(hào)A管試劑迅速加入溫度對(duì)應(yīng)的B管中(為了最大限度保證酶的量)，此時(shí)為計(jì)時(shí)的起點(diǎn)（使用秒表），搖勻后放回對(duì)應(yīng)溫度繼續(xù)水浴。注意：轉(zhuǎn)移A管試劑前需將其搖勻。3時(shí)間控制然后每隔1min或2min（時(shí)間自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6號(hào)的A、B管混合 ，嚴(yán)格控制好時(shí)間。4中止反應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)13min，向1號(hào)管加入2滴1M HCl溶液，立即混勻，中止反應(yīng)，按上

11、一步的順序和時(shí)間間隔依次對(duì)各管進(jìn)行操作，并移至試管架。后再各用2滴1M NaOH溶液中和每管。5顯色在每管中各加入2ml 0.03175g/L碘液并混勻，觀察現(xiàn)象。6比色若不同溫度梯度間現(xiàn)象差別不明顯，則進(jìn)行比色，通過(guò)光密度值來(lái)比較。【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值），做出合理分析。【注意事項(xiàng)】嚴(yán)格注意時(shí)間的控制及各物質(zhì)的添加量。【思考題】如果某同學(xué)（沒(méi)有嚴(yán)格按照教案步驟）做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為唾液淀粉酶的最適溫度為70度，請(qǐng)分析他得出這樣的結(jié)果的可能原因。實(shí)驗(yàn)（三）PH對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解PH對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。【實(shí)驗(yàn)原理】 1.PH對(duì)酶活性影響的機(jī)理

12、：PH影響酶活性中心的某些必須基團(tuán)的解離,而這些基團(tuán)往往僅在某一解離狀態(tài)時(shí)才最容易同底物結(jié)合或具有最大催化活性；PH影響可解離基團(tuán)的底物和輔酶的荷電狀態(tài),從而影響酶對(duì)他們的親和力；PH還可以影響酶活性中心的空間構(gòu)象,從而影響酶的活性。 2.本實(shí)驗(yàn)用唾液淀粉酶為材料來(lái)觀察酶活性受PH的影響的情況。淀粉在該酶的催化作用下會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)不同程度的水解,從而得到各種糊精乃至麥芽糖,少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。碘液與淀粉及其不同程度的水解產(chǎn)物反應(yīng)呈現(xiàn)不同顏色,即淀粉(藍(lán)色)、紫色糊精(紫色)、紅色糊精(紅色)、麥芽糖及少量葡萄糖(黃色)。【儀器與試劑】?jī)x器：1、冰箱 2、電爐 3、恒溫水浴鍋 4、試管

13、架及試管5、移液管架及移液管試劑：1、0.2M磷酸氫二鈉溶液：稱取35.61g含2個(gè)結(jié)晶水的磷酸氫二鈉，用水定容至1L。2、0.1M檸檬酸溶液：稱取21.01g含一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：將唾液分別稀釋10倍、50倍和100倍，得三種不同濃度的酶液、4、0.5%淀粉的0.5%氯化鈉溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化鈉，溶于100ml蒸餾水（需加熱）。5、0.1%淀粉液：0.1g可溶性淀粉，加到100ml蒸餾水中，加熱溶解。6、碘液：15g碘化鉀和12.7g碘，加少許水使碘完全溶解后，再用水稀釋至200ml。7、1%氯化鈉溶液。8、0.1%硫酸銅溶液。【實(shí)驗(yàn)步驟】（

14、一）PH對(duì)酶活性的影響1、緩沖溶液的配制取六只潔凈的三角燒瓶，按表1編號(hào)和加試劑： 表1 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制管號(hào)123456PH值5.46.26.87.07.48.0緩沖液量（ml）333333含Nacl的0.5%淀粉（ml）222222稀釋100倍唾液（ml）222222充分搖勻，37水浴保溫，嚴(yán)格控制時(shí)間5min后，立即向各管加入碘液碘液（滴）333333充分搖勻，觀察各管顏色差異三角燒瓶號(hào)123456PH值5.46.26.87.07.48.00.2M磷酸二氫鈉（ml）11.1513.2215.4516.4718.1719.450.1M檸檬酸（ml）8.856.784.553.

15、531.830.55 取六支潔凈試管，編號(hào)后按表2操作： 表2 pH對(duì)酶活性的影響 【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值），做出合理分析。【注意事項(xiàng)】充分搖勻，嚴(yán)格控制時(shí)間。【思考題】酶的最適PH值受哪些因素影響？實(shí)驗(yàn)（四）酶濃度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私饷笣舛葘?duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。【實(shí)驗(yàn)原理】 在適宜的條件下，若反應(yīng)物濃度大大高于酶濃度時(shí)，反應(yīng)速度隨酶濃度增加而增加，兩者間成正比。但若反應(yīng)底物濃度較低，而且酶的濃度足夠高時(shí)，增加酶濃度，反應(yīng)速度基本不變。本實(shí)驗(yàn)采用唾液淀粉酶為例。加入不同濃度的酶，并比較在同一適當(dāng)時(shí)間后，以碘檢驗(yàn)淀粉的含量從而確認(rèn)其反應(yīng)程度。【

16、儀器與試劑】?jī)x器：1. 恒溫水浴鍋 2. 吸量管3. 試管與試管架試劑：1. 含NaCI的0.5%淀粉液2. pH7.0的緩沖液3. 分別稀釋過(guò)10倍、50倍和100倍后的唾液【實(shí)驗(yàn)步驟】1.取3支潔凈試管，按下表加入淀粉液，緩沖液，加畢放入37度恒溫水浴鍋中保溫5分鐘；2.保溫后，快速加入不同濃度的稀釋唾液，搖勻，立即放入37度恒溫水浴中，并計(jì)時(shí)。約3至4分鐘后加入等量碘液一至兩滴，立即搖勻后，記錄各管的顏色。管號(hào)含NaCI的0.5%淀粉液/mLpH7.0的緩沖液/mL稀釋唾液/mL顏色10倍50倍100倍132123213321【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象，做出合理分析。【思考題】實(shí)驗(yàn)（五）離子對(duì)

17、酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私怆x子對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。【實(shí)驗(yàn)原理】酶的活性常常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增加，稱為酶的激活劑；有些物質(zhì)能使酶的活性降低，稱為酶的抑制劑。Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。其它的陰離子，如Br-、NO3-和I- 對(duì)該酶也有激活作用，但較微弱。而Cu2+對(duì)唾液淀粉酶具有抑制作用。激活劑和抑制劑影響酶活性的劑量是很少的，并且常具有特異性。就本實(shí)驗(yàn)，低濃度CI-可以增加酶活性，高濃度的CI-或者低濃度的Cu2+則會(huì)抑制酶活性，同時(shí)低濃度的Na+、SO42-等對(duì)酶活性沒(méi)有影響。激活劑的作用機(jī)制是多種多樣的，可能是作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分，也可以直接作為酶活性中心的構(gòu)成部分。【儀器