1、作者簡介 吳富忠 (1964-, 男 , 副主任技師 , 主要從事衛生理 化檢驗工作。 化學測定方法蔬菜 、 水果及其制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的 HPLC 法測定 吳富忠 , 王恒(浙江省舟山市疾病預防控制中心 , 浙江 舟山 316021摘要 目的 :建立蔬菜、 水果及其制品中亞硝酸鹽與硝 酸鹽的高效 液相色譜 同時測定方 法。 方法 :樣品 中亞硝酸 鹽與 硝酸鹽用超純水 浸提或超聲提取 , 經 活性炭 脫色 后過濾 或離 心沉淀 , 濾 液或 上清 液經 0. 45 m 水相 膜過 濾后 進樣 , 在 Pheno m enex S AX 色譜柱上 , 以 0. 01mo l/L磷酸二氫鉀為

2、流動相進行分 離 , 205n m 檢 測 , 外 標法定 量。 結果 :該法最 低檢 出量分別為亞硝 酸鹽氮 0. 1mg /kg、 硝 酸鹽氮 0. 07m g /kg。樣品 加標回 收率 , 亞 硝酸 鹽為 91. 0%101. 9%、 硝酸 鹽為 94. 7%106. 0%, RSD <5%。 結論 :該方法操作較簡單 , 靈敏度高 , 速度快 , 干 擾少 , 結果準 確 , 適用于 蔬菜、 水果及 其制 品中亞硝酸鹽與 硝酸鹽的同時測定。關鍵詞 高效液相色譜法 ; 蔬菜 、 水果及其制品 ; 亞硝酸鹽 ; 硝酸鹽中圖分類號 O 657. 7+2 文獻標識碼 A 文章編號 10

3、04-8685(2010 11-2741-03 Determ ination of nitrite and nitrate in vegetables, fruits and derived products by HPLCW U Fu -zhong , WAN G H eng(ZhoushanM un icipa l Center for D isease Contro l and P reven tion , Zhoushan 316021, Ch i naAb stract O b jective :T o deve l op a m ethod for deter m i nati o

4、n o f n itr ite and n itrate in vegetables , fru its and derived products by h i gh perfo r m ance li qui d chroma tog raphy . M ethods :T he analytes w ere ex tracted w ith u ltrapure wa ter u ltrason icall y wave , and then deco l orated w it h active carbon or cen trifug ed , filtrate o r supe rn

5、ate w as filtered by 0. 45 m filter membrane . T he sepa ration w as carr i ed out on a Phenom enex S AX co l u m n w ith 0. 01m o l/Lmonopotassi u m phospha te as m ob ile phase and detected at 205nm T he quantifica ti on w as acco m pli shed by exte rnal standard m ethod . Re s u lts :T he detecti

6、on li m its o f thism e t hod f o r n i trite -n itrogen and n itrate-n i trogen w as 0. 1m g /kgand 0. 07mg /kg,and the recover i es w ere ranged fro m 91. 2%101. 9%and 94. 7%106. 0%respecti ve l y w it h R S D s l ess than 5%.Con clusi on :T he m ethod i s si m ple , sensiti ve , rap i d , practi

7、ca, l accu ra te and w hich is su itab l e for the de ter m i na ti on o f nitrite and nitrate in vegetab l es , fru its and de ri v ed products .K ey words HPLC ; V egetab l es ; F ru its and der i ved produc ts ; N itrite ; N itra te蔬菜、 水果及其 制品 中亞硝 酸鹽 和硝 酸鹽 的標 準測 定方 法是 G B /T15401-1994! 水果、 蔬菜及其制品

8、亞硝酸鹽和硝酸 鹽含量 的 測定 和 GB /T5009. 33-2010食品 安 全國 家 標準 ! 食品中亞硝酸鹽與硝酸 鹽的 測定 , 兩標 準均采 用鹽 酸萘乙 二胺直接 顯 色 法和 鎘 柱 還 原 法測 定 ; 其 中 GB /T5009. 33-2010食品安全國家標準新增了離子 色譜法。在標 準檢測方法 中 , 硝 酸 鹽 的 測 定 , 化 學 比 色 法 需 通 過 鎘 柱 還 原 為 亞 硝 酸 鹽 1, 2; 離子色譜法需將樣品提取液經多 種預處理 小柱處理后 才能進樣且出 峰時 間較長 2, 操 作均 較繁 瑣。本研 究根 據實 際 , 將樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽用 去

9、離子 水浸提 , 活性 炭脫色 后過濾或離心沉 淀 , 濾液或 上清液經 0. 45 m 水相膜 過濾 , 濾 液直接進樣 , 205n m 紫外檢測 , 結果準確、 快 速 , 能 同時測定蔬 菜、 水果及其制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽。 1 材料與方 法1. 1 儀器A g ilen t 1100液相色譜 儀 (美國 安捷 倫公 司 , 包 括 Ag ilent Che m Stati on 工作站、 四元梯度泵、 真空 脫氣箱、 恒溫 柱溫箱、 紫 外檢測器。M illipore M illi-Q 純水 系統 (Mo lshe i m F rance; O r i on 828型 p H 計

10、(U S A ; I KA T25可調高速勻 漿機 (德國 ; SB2200超 聲波清 洗器 (上 海 Branson ; 水 浴 箱 ; 離心 機 (4000r /mi n ; J Y 5002型電子天平 (精度 0. 01g, 上海精宏科器 。1. 2 試劑0. 01mo l/L磷 酸 二 氫 鉀 (HPLC 級 , 10%磷 酸 調 p H 至 3. 2 ; 10%磷酸 ; 220g /L乙酸鋅 ; 106g /L亞 鐵氰化 鉀 ; 超純水 (電阻率為 18. 2M #c m ;標準 儲 備 液 :稱 取 優 級 純 亞 硝 酸 鈉 0. 2463g 、 硝 酸 鈉 0. 2963g 溶

11、于水 并定容至 500m , l 濃度為 0. 1m g /ml(以氮 計 , 下同 。2741中國衛生檢驗雜志 2010年 11月 第 20卷 第 11期 Ch i n ese Jou r n al ofH ealth Laborat ory Tec hno l ogy , Nov 2010; Vo l20 N o 111. 3 色譜條件檢測波長 :205nm ; 色 譜柱 :Phenomenex S AX 80A (250 4. 6mm 5 m ; 流 動相 :0. 01m o l/L磷 酸二 氫 鉀 溶液 (p H =3. 2; 流速 1. 5m l/mi n ; 柱溫 :30%; 進樣

12、量 10 l 。 1. 4 實驗方法1. 4. 1 試樣測定 取新 鮮蔬菜中 食用部 分 , 用自來水 洗去泥 土 , 然后用去離子水漂凈、 涼干、 切碎 , 水 果 (去 核 及其制品剁 碎后 , 稱取 50g 左右樣品 與水按 1&1比例 用高速 勻漿 機勻漿 后稱取 10g , 加約 80m l 水 , 70%水浴提取 20m i n , 冷卻后各加 1m l 220g /L乙 酸鋅 和 106g /L亞 鐵氰 化 鉀 溶 液 , 水 定 容至 100m , l 加適量活性炭脫 色 , 混勻后 過濾 或離 心沉淀。 濾液或 上清液經 0. 45 m 濾 膜 過濾 至 自 動 進

13、樣器 樣 品 瓶 中 , 進樣 10 l 測定。液體樣品按固 形物含量 不等 1&11&5直 接用水 稀釋 , 從冷卻后按固體樣品方法處理。1. 4. 2 標 準 曲 線繪 制 各 準 確 吸 取 0. 1m g /ml 標 準 溶液 10. 0m l 于 50m l 容量瓶 , 用 水稀釋至刻度 , 配成 20. 0 g /ml 亞 硝 酸 鹽 氮、硝 酸 鹽 氮 溶 液 , 再 逐 級 稀 釋 10倍 稀 釋 成 2. 00 g /ml 、 0. 20 g /ml 、 0. 02 g /ml 標 準系 列溶 液 , 分 別進 樣 10 l 。 以亞硝酸鹽氮、 硝酸鹽氮含量為

14、橫坐標 , 峰面積為縱 坐標 , 繪制標準曲線。 2 結果與討論 2. 1 實驗條件選擇2. 1. 1 樣品預處 理 由 于蔬 菜、 水果 及其 制品 中蛋 白質、 脂 肪等大分子有機 干擾 物質含 量極 低 , 且此 類樣 品中 含有 大量 的水分 , 有形成分中除纖維素外主 要是一 些水溶 性維生 素、 糖 類、 無機鹽、 有機 酸等 小分 子物 質。因 此 , 樣品 中目 標成 分的 提取與凈化變得 非常 簡單 , 只需 用去 離子 水浸 提后 用活 性炭 脫色 , 以減少葉綠素等色素對測定的 影響。試驗了 70%水浴、 不同時間直接浸提與 加約 70%水后超聲提取不同 時間時的提 取效

15、 果。試 驗 結 果 表 明 在 70%溫 度 時 , 兩 種 提 取 方 法 在 15m in60m i n , 提 取 效果 相 同。標 準添 加 回收 達 到 91%106%。本法選用 70%水浴直 接浸提 20m i n 。 2. 1. 2 色譜條件選擇2. 1. 2. 1 色譜柱 不同的色譜柱因性能不 同對目標成分的分 離能力差異很大。文獻資料中 測定硝 酸鹽與 亞硝酸鹽 基本上 采用不同品牌的 C 18柱 3,4, 7或 OD S 柱 5, 6, 因被測 成分的強陰 離子特性 , 需用離子對試劑與硝酸 根、 亞硝酸 根陰離子 形成中 性締合物才能測定。而色譜柱 對含有 離子對 試劑

16、的流 動相進 行初始平衡時 , 色譜柱吸收和釋放 離子對 試劑的 過程緩 慢 , 色 譜柱平衡較慢 , 需 在確 保保留 值能 重現 后再 進行 測定 4。因 此 , 根 據 被 測 成 分 的 強 陰 離 子 特 性 , 選 用 強 陰 離 子 交 換 柱 (SAX 進行測定。2. 1. 2. 2 流動相 流動相對被測成分與干 擾成分的分離影響 主要有三個方面 :流 動相 本身 組成 ; 流 動相 濃度 與流 速 ; 流動 相的 p H 值。高效液相色 譜法中 流動 相的 選擇隨 色譜 柱和分 離對象的不同而不同。本 方法參 考文獻 35, 7, 分別用 磷酸二 氫鉀溶液、 甲醇 -磷 酸鹽

17、溶 液和 乙腈 -磷 酸二 氫鉀 溶液 作流 動相 , 并進行比對。試驗結果表明 , 文獻 4, 5, 7介紹 的流動相在 , 3分離 , ,出峰快。在其他條件相 同下 , 流 動相用 0. 02m o l/L和 0. 01mo l/L濃度的磷酸二氫鉀溶液 , 目標成分 的出峰時 間 , 低濃度 時亞硝 酸根 和 硝 酸 根 出 峰 時 間 顯 著 延 長。 如 在 p H 3. 2、 流 速 1. 0m l/mi n 時 , 亞硝酸根 和硝酸根出峰時間分別從約 7. 2m i n 、 9. 8m i n 延長 到 12. 5m i n 、 15. 5m i n , 且 信號值 相同。經試 驗

18、 , 用 p H =3. 2的 0. 01m ol/L磷 酸 二 氫 鉀 溶 液 , 流 速 為 1. 5m l/mi n 時目標組分間和 目標 組分與 干擾 成分間 分離 效果 達到最佳 , 且目標成分出 峰時間 較流 速為 1. 0m l/mi n 提 前到 流速為 1. 0m l/mi n 流 動相 濃度 0. 02m o l/L磷 酸二 氫鉀 時相 同。流動相 p H 影 響 :由于色譜柱性能關系 , 流動相的 p H 對目 標組分分離度有很大影響。流速為 1m l/mi n , 0. 02m o l/L磷酸 二氫鉀溶液 p H 3. 7時 , 目標成分 間分離不 完全 , p H 3

19、. 9兩 峰重疊 ; 而用稀 磷酸調 流動相 p H (3. 6時 , 兩峰分 離完全 , 且 亞硝酸根的出峰時間隨流動相 p H 的降低明顯 提前 , 硝 酸根的 出峰時間延后 , 兩目標組分的分離度增大 , 分離更加良好 。 2. 1. 2. 3 柱溫 由于色譜柱 為強極 性陰離 子交換 柱 , 在固定 其他條件下經試驗 , 20%、 30%、 40%柱溫時對目標成分分離與 出峰時間基本不產生影響 , 本法采用 30%。2. 1. 2. 4 波長 參考文獻 , 對亞 硝酸鹽 和硝酸 鹽進行 紫外吸 收波長掃描 , 亞硝酸鹽最大吸收波長為 202n m 210n m, 硝酸 鹽最大吸收波長為

20、 201nm 206n m, 在 200n m 210nm 波長 范圍 , 最大吸光度相對平坦 , 大 于 210n m 吸 光度下 降明顯 , 本 法選用 205n m 。根據以上 試驗 結 果 , 選 擇優 化 色 譜分 離 條件 :流 動相 為 0. 01m o l/LKH 2PO 4-H 3PO 4緩 沖 液 (p H =3. 2 , 流 速 1. 5m l/mi n , 檢測波長 205n m, 柱溫 30%。標準色譜圖見圖 1。圖 1 亞硝酸鹽與硝酸鹽標準色譜圖 (1:NO -2; 2:NO -32. 1. 3 干 擾 試 驗 常 見 的 無 機 陰 離 子 C l -、 SO 2

21、-4、 SO 2-3、 PO 3-4、 CO 2-3、 F -等及山梨 酸、 苯甲 酸、 甜蜜 素、 糖 精鈉、 安 賽蜜 等常用的食品添加劑 , 對硝酸鹽和亞硝酸鹽測定不產生干擾。 2. 2 線性范圍與最低檢出限2. 2. 1 線性范圍 在本實 驗條件 下 , 亞 硝酸鹽 氮與硝 酸鹽氮 含量在 0. 02 g /ml 20. 0 g /ml 范圍 , 標準含量 C 與峰面積 A 有良好的線性關系 , 標準系列回歸方程分別為 A =160. 842C +0. 4487, A =340. 098C+0. 3612其相關系數均大于 0. 9995。 2. 2. 2 最低檢 出限 取濃度 為 0.

22、 020 g /ml 標準 溶液 進樣 10 l 分 析 , 按 3倍 聲 噪 比 (S /N 計 , 本 法 最 低 檢 出 限 為 0. 005 g /ml 、 0. 0035 g /ml 。 若取 5. 0g 原 樣 品提 取 定容 至 100m l 測 定 , 對 應 的 最 低 定 量 檢 出 量 為 0. 1m g /kg、 m 2742中國衛生檢驗雜志 2010年 11月 第 20卷 第 11期 Ch i nes e J ournal ofH ealt h Lab oratory T echnol ogy , N ov 2010; Vol 20 No 112. 3 方法加標回收率

23、試驗取 10g 左右 1&1打成 勻漿軟 包裝 蔬菜制 品和 腐菜 樣品 , 分 別加入 20 g /ml 的標準液 1. 00m l 、 5. 00m l 、 50. 0m , l 按 1. 4實驗方法提取后測定 , 結果見表 1。表 1 加標回收試驗結果樣品 編號 NO -2-N 本底值 ( g /m l 加標量( g /ml 加標測定 值 ( g /ml 回收率 (% NO -3-N 本底值 ( g /ml 加標量 ( g /m l 加標測定 值 ( g /m l 回收率(% 1ND 0. 200. 18291. 03. 206/2ND 1. 000. 99299. 23. 20

24、61. 004. 246104. 03ND 10. 0010. 08100. 83. 20610. 0013. 43102. 240. 1510. 200. 34195. 00. 6130. 200. 825106. 050. 1511. 001. 170101. 90. 6131. 001. 59798. 460. 15110. 0010. 1199. 60. 61310. 0010. 0894. 7注 :ND: 未檢出2. 4 方法精密度試驗在 新 鮮 蔬 菜、 軟 包 裝 蔬 菜 制 品 和 果 汁 樣 品 , 分 別 加 入 100 g 標準液 , 各測定 6次 , RSD 值 NO

25、-2在 1. 59%4. 37%、 NO -3在 2. 07%4. 68%之間。 2. 5 方法比較用本法和 GB 5009. 33-2010食品中亞 硝酸鹽與硝酸鹽測 定不同樣品進行方法 比對 , 結果見下表 2。將數據各自進行配對 t 檢驗 , 計算得 t 亞硝酸 鹽 =1. 272, t 硝酸鹽 =1. 228, 查 t 值表 , 均小 于 t 0. 2, 4=1. 533, 故 P >0. 2, 2組結 果均 無顯 著性 差異。 因此 兩種檢測方法 的測定 結果 無顯著 性差 異。 (亞 硝酸 鹽測 定配 對 t 檢驗時 , 統計量指標中 ND 取 1/2值 。表 2 國標法與本法對不同樣品測定結果檢測項目 樣品名稱 亞硝酸鹽 (mg /kg本法 國標法 硝酸鹽 (mg /kg本法 國標法 新鮮蔬菜 蘋果 軟包裝榨菜 瓶裝果汁 腐菜ND ND ND ND 3. 00ND ND ND ND 2. 942. 734. 7864. 34. 6412. 32. 685. 0866. 24. 5112. 5注 :ND :表示小于方法檢出限 (本法 ND<0. 1m g/kg, 國標法 ND<0. 2m g/kg3 小結試驗 采用 25c m Phenom enex S