1、透明質酸紫杉醇聚電解質復合納米粒口服給藥研究目的目的口服+靶向（1）口服化療相對于注射化療來說具有很多優勢，例如它改善了病人的依從性， 降低了設備及人力成本，促進了晚期的或轉移性癌癥患者的慢性治療，口服化療提出了一個新的化即“化療在家里”（2）就是擊中靶標，減少毒副作用內容提要內容提要腫瘤靶向簡單介紹紫杉醇的藥理作用聚電解質和納米粒的簡單介紹口服給藥的研究制備的介紹未來的前景 腫瘤的分子靶向治療是指利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應盡量限定在特定的靶細胞、靶組織或靶器官內，而不影響正常細胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減

2、少毒副作用的一種方法。定義腫瘤靶向治療腫瘤靶向治療v依據已知腫瘤發生中涉及的異常分子和基因，設計針對依據已知腫瘤發生中涉及的異常分子和基因，設計針對這些特定分子和基因靶點的藥物，選擇性殺傷腫瘤細胞。這些特定分子和基因靶點的藥物，選擇性殺傷腫瘤細胞。這種治療方法稱為腫瘤藥物的分子靶向治療這種治療方法稱為腫瘤藥物的分子靶向治療(Molecular targeted therapy)。 藥物靶向治療的效果取決于靶向藥物的自身特性和腫瘤內是藥物靶向治療的效果取決于靶向藥物的自身特性和腫瘤內是否存在靶向藥物作用的分子靶點。否存在靶向藥物作用的分子靶點。 只對某個器官的腫瘤有效，如腫瘤 的介入治療、射頻熱

3、療等。器官靶向：細胞靶向： 分子靶向：選擇性地與這類細胞特異性地結合，從而消滅 腫瘤細胞，如I131、希羅達、脂質體阿霉素等針對腫瘤細胞特有的受體，關鍵基因和調控分子為 靶點的治療（阻斷信號傳導通路中某一個分 子靶點）腫瘤靶向治療的三個層次分類1、抗體免疫偶聯物2、封閉類抗體藥物3、作用于信號傳導類藥物4、效應子殺傷類藥物5、抗獨特性疫苗類抗體藥物6、納米技術改造的藥物目前主要分子靶向藥物目前主要分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼（Gefitinib）、埃羅替尼（Erlotinib）、克唑替尼抗EGFR單抗西妥昔單抗（Cetuximab）、帕尼單抗（PANITUMUMAB）Bcr-Abl酪氨

4、酸激酶抑制劑伊馬替尼（Imatinib）、尼洛替尼（Nilotinib）、達沙替尼（Dasatinib）抗血管內皮生長因子受體（VEGFR）的單抗貝伐單抗（Bevacizumab）抗CD20的單抗利妥昔單抗(Rituximab)IGFR-1激酶抑制劑NVP-AEW541mTOR激酶抑制劑Temsirolimus(CCI-779)、Everolimus(RAD-001)泛素-蛋白酶體抑制劑硼替佐米（Bortezomib）。 多靶點抑制劑舒尼替尼（Sunitini）、索拉非尼（Sorafinib）、拉帕替尼（Lapatinib）、范德他尼(Vandetanib)等由抗體和特異的效應分子連接形成作用

5、靶點 分化抗原、癌胚胎性抗原偶聯物的種類 化療藥物、放射性核素、毒素代表性藥物： 利妥昔單抗抗體免疫偶聯物紫杉醇的各種參數紫杉醇的各種參數化學名稱 : 5，20-環氧-1，2，4，7，10，13-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13（2R，3S）-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯分 子 式 : C47H51NO14分 子 量 : 853.92物理性質 : 白色結晶體粉末。無臭，無味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機溶劑。紫杉醇紫杉醇發現歷史1963年美國化學家瓦尼（年美國化學家瓦尼（M.C. Wani）和沃爾（）和沃爾（Monre E. Wall）首次從一）首次

6、從一種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉（種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉（Pacific Yew）樹皮和木材中分）樹皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。在篩選實驗中，離到了紫杉醇的粗提物。在篩選實驗中，Wani和和 Wall發現紫杉醇粗提物對離發現紫杉醇粗提物對離體培養的鼠腫瘤細胞有很高活性，并開始分離這種活性成份。由于該活性成體培養的鼠腫瘤細胞有很高活性，并開始分離這種活性成份。由于該活性成份在植物中含量極低，直到份在植物中含量極低，直到1971年，他們才同杜克大學的化學教授姆克法年，他們才同杜克大學的化學教授姆克法爾（爾（Andre T. McPhail）合作，通過）合作，通過x-射線

7、分析確定了該活性成份的化射線分析確定了該活性成份的化學結構學結構一種四環二萜化合物，并把它命名為紫杉醇（一種四環二萜化合物，并把它命名為紫杉醇（taxol）。）。臨床應用臨床應用 臨床研究上，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、臨床研究上，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。 紫杉醇是新型抗微管藥物紫杉醇是新型抗微管藥物,通過促進微管蛋白聚合抑制解聚通過促進微管蛋白聚合抑制解聚,保持微管保持微管蛋白穩定蛋白穩定,抑制細胞有絲分裂。體外實驗證明紫杉醇具有顯著的放射增敏作用，抑制

8、細胞有絲分裂。體外實驗證明紫杉醇具有顯著的放射增敏作用，可能是使細胞中止于對放療敏感的可能是使細胞中止于對放療敏感的G2和和M期。期。 靜脈給予紫杉醇靜脈給予紫杉醇,藥物血漿濃度呈雙相曲線。本品蛋白結合率藥物血漿濃度呈雙相曲線。本品蛋白結合率89%98%,紫紫杉醇在肝臟代謝。紫杉醇主要在肝臟代謝，隨膽汁進入腸道，經糞便排出體杉醇在肝臟代謝。紫杉醇主要在肝臟代謝，隨膽汁進入腸道，經糞便排出體外（外（90%）。）。副作用副作用易引起過敏、骨髓抑制、心動過緩、低血壓、易引起過敏、骨髓抑制、心動過緩、低血壓、外圍神經病、肌痛、關節痛、惡心、腹瀉、黏膜炎和禿頭癥等外圍神經病、肌痛、關節痛、惡心、腹瀉、黏

9、膜炎和禿頭癥等：大多數抗癌藥物低的溶解度、低穩定性和低吸收性，低生物利用度腸道或肝臟部位的細胞色素P450 酶對疏水性藥物有代謝胃液環境下或酸性條件下P-糖蛋白（P-gp）過表達引起了腫瘤組織的多藥耐藥性亟待解決的問題1.穩定存在于胃液環境3.在載體表面鍵接特定抗體或配體實現主動靶向2.利用靶向治療控制藥物載體的納的粒徑在納米級能夠高通透和滯留（EPR）效應實現被動靶向實現組織、器官或細胞的靶向改善的方面提高口服抗癌藥物的生物利用度的同時降低其毒副作用4.利用給藥載體的pH 敏感殼聚糖（CS）聚電解質復合物（+-）殼聚糖納米微粒具有附著在生物體粘膜表面的特性，且生物薄膜表面的類脂層的負電荷易發

10、生靜電吸附增強了大分子藥物透過粘膜吸收的能力，尤其適用于口服給藥途徑，延長了藥物在體內的循環時間，有效地提高藥物的生物利用度，減少副作用設計安全有效的殼聚糖給藥體系，適用于多肽、蛋白質類的藥物制劑殼聚糖及其衍生物能夠以凝膠、顆粒、片劑、薄膜及微囊等的形態包封藥物，應用于藥物緩釋和定向輸送可降解性、低毒性、良好的生物相容性殼聚糖基聚電解質復合物納米粒作為藥物載體具有控制藥物釋放延長藥物療效、降低藥物毒副作用及提高疏水性藥物對細胞膜的通透性作用1、透明質酸一種天然多糖是細胞外基質的主要成份之一，具有低毒、生物相容性、可降解性及高度水合性等物理化學性能2.在一些惡性腫瘤或實體瘤邊緣組織發現了大量透明

11、質酸受體CD44，它能夠與透明質酸結合達到將其包吞的性能。3.透明質酸酶是廣泛分布于腫瘤細胞外基質，在降解透明質酸的過程中扮演著重要角色。總結實體瘤中CD44 與透明質酸的這種關系，正好為化療藥物的靶向性輸送提供了一種可能的途徑，即通過透明質酸與CD44 受體結合介導的胞吞作用將藥物靶向輸送到腫瘤細胞內。透明質酸納米粒納米粒（1）直徑小于500 nm，能在血液循環中經由毛細血管到達腫瘤部位（2）納米材料載體可在體內降解（1）.聚合物包封藥物進而形成如籠和膠囊的納米結構納米粒是指粒徑為10-1000 nm 的固態膠體顆粒，聚合物納米粒子已經被廣泛地應用于納米藥物載體作為理想的納米載藥輸送系統要有

12、以下特性三、載藥納米粒是通過以下兩種方式形成（2）通過一個簡單的酯鍵或酰胺鍵化學連接藥物到聚合物骨架上禁食狀態下胃部的pH 大約為胃胃腸飯后胃膜細胞會分泌出酸來消化所吸收的食物此時胃部的pH 約為小腸最上端的pH 約為，中部和尾部的空腸和回腸pH 約為7.4。PHpH 大約為腫瘤細胞外腫瘤細胞內正常組織細胞內涵體內pH 約為溶酶體內pH 約為pH 約為7.4。PH實驗預期CS/HA-PTX CNPs是表面富集殼聚糖的帶正電荷的聚電解質復合納米 粒，而胃腸道組織中富含帶負電荷的糖胺多糖，通過兩者之間的正負電荷的相互 作用，明顯增加聚電解質復合納米粒在胃腸道壁中的吸收和駐留，使得聚電解質復合納米粒

13、能夠與胃腸粘膜上皮細胞充分接觸，被上皮細胞粘附并吸收，通過 殼聚糖打開腸壁粘膜上皮細胞間結點，進而使得HA-PTX NPs進入血液循環，然 后通過透明質酸介導的主動靶向作用和EPR效應成功地積聚在腫瘤組織。以pH敏感的 殼聚糖/透明質酸-藥物的給藥系統，相比于游離的藥物溶液直接口服，能夠達到 保證藥物在胃腸道長時間滯留，維持藥物在腫瘤部位的緩慢、持久釋放，進而達 到提高腫瘤部位的藥物濃度，而且降低其對正常細胞的細胞毒性實驗方面實驗方面 合成 檢測細胞毒性體內組織分布實驗釋放度PH影響胞吞實驗婁瑩等.CYP2C9和VKORCI基因多態性對肺栓塞患者華法林維持劑量的影響J.中國藥物警戒，2012，

14、9（4）HA-PTX 較透明質酸的主要區別在于 891、1378 及 2893 cm-1 處的吸收增強，1618 cm-1 處 C=O 雙鍵吸收峰變成尖銳的 強峰，證明了透明質酸中的羧基發生了反應且有新的甲基吸收出現，出現共軛 C=O 吸收峰，由此可以初步判定紫杉醇連接到了聚合物上化學位移在 7-8 ppm 的新峰代表了紫杉醇的特征峰，從而證明了我們利用化學共價鍵接成功合成了 HA-PTX。與紫杉醇對比，HA-PTX 鍵合物在 D2O 中紫杉醇在 7-8 之間的峰不明顯，而在它的良溶劑 DMSO-d6 中， 7-8 之間的峰明顯出現，這說明形成的 HA-PTX 為核殼結構。HA-PTX 鍵合物

15、中鍵合物中 PTX 的含量的含量 通過配置不同濃度的紫杉醇的乙腈溶液，用 HPLC 測試其出峰面積，以濃度 對峰面積作圖，得到紫杉醇的峰面積-濃度標準曲線紫杉醇的峰面積與其濃度呈線性關系，經擬合得： Y=7.4871110-5X，其中 Y 為紫杉醇濃度，X 為峰面積。根據此線性關系，測定 已知濃度 HA-PTX 鍵合物的出峰面積，可以計算出其中紫杉醇的濃度，進而根 據公式 3-1 計算出 HA-PTX 中紫杉醇的含量為 10.6 wt%隨著 pH 值的增加，HA-PTX NPs 的電 位呈現下降的趨勢，由 5 mV 降低到-31 mV；當 pH 值為 2.1 時，納米粒的 Zeta 電位接近于

16、 0，說明納米粒的 pKa 為 2.1.HA-PTX NPs的電位圖 3-7 A 為 HA-PTX 的電鏡照片，由材料的凍干粉再分散，制備濃度為 1 mg/mL 的材料，用透射電鏡觀察其形貌，平均粒徑 約為 50 nm 左右，呈球形，粒徑分布較均勻，分散性好。透明質酸與紫杉醇通過共價鍵結合，自發地聚集形成殼-核的結構，紫杉醇被保護在膠束的內核中，膠 束外層由親水性的透明質酸構成。如圖 3-7 B 所示，由激光粒度儀測定的納米粒 的粒徑約為 80 nm 左右比之從 TEM 中觀察的要高，這是由于在用透射電鏡觀測 粒徑時納米粒是處于一個干態的，而在用激光粒度儀測定粒徑時，納米粒的親水 性部分能夠在

17、溶液中以一個伸展形式存在。圖 3-8 為通過熒光光譜法對一系列濃度的 HA-PTX 鍵合物水分散液進行芘 激發光譜掃描后，以 I338/I333 對不同 HA-PTX 鍵合物濃度的對數 logC 做的兩條 直線，如圖所示，當鍵合物濃度較低時，呈現一條接近于水平的直線，當鍵合物 濃度增大到一定程度時， I338/I333突然增大，這表明芘從親水環境中被包進了疏水 區域，此時膠束開始形成。兩條曲線的交點即是 HA-PTX 鍵合物的臨界膠束濃 度，大約是 110-3 mg/mL。小結一在 DCC 和 DMAP 的催化作用下，通過酯化反應制備了 HA-PTX 鍵合物，FT-IR 及 1H-NMR 結果

18、表明，目標產物被成功合成且可自組裝成核-殼 型結構。HPLC 結果表明 HA-PTX 中紫杉醇的含量為 10.6 wt %。粒徑及電位結 果表明 HA-PTX 能在水中形成納米粒且 pKa 值為 2.1，TEM 說明 HA-PTX 在水 中能自組裝成粒徑約為 80 nm 左右的納米粒，臨界膠束濃度為 110-3 mg/mLHA-PTX CNPs除了正負 電荷比（CS中的正電NH3+與HA-PTX中的負電-COO-）為1:1時，無法形成聚電解 質復合納米粒，在其他電荷比如3:2、2:1、3:1和4:1時均能形成粒徑約為160-350 nm的CS/HA-PTX CNPs。當正電荷的CS的量遠遠超過

19、了帶負電荷的HA-PTX 時，過量的CS分子覆蓋在CS/HA-PTX CNPs表面，形成高溶解性的聚電解質復 合納米粒。綜合各電荷比下的粒徑及載藥量，電荷比為2:1時聚電解質復合納米 粒具有較小粒徑與較高載藥量，進而取其為最佳合成條件CS/HA-PTX CNPs圖 4-2 A 中，在 2106 cm-1 和 1412 cm-1 處出現了吸收峰， 該峰的出現可能是由于為殼聚糖上的-NH3+與 HA-PTX 納米粒凍干粉上的-COO發生了靜電復合作用。 4CS/HA-PTX CNPs其中當pH 值為5.0時，聚電解質復合納米粒的粒徑最小，這就說明此由聚陽離子與聚陰離 子合成的聚電解質復合納米粒在p

20、H 5.0時穩定性最好。當pH值為1.2或7.4時，聚 電解質復合納米粒崩解，這是由于在pH 1.2下聚陰離子HA-PTX產生了去質子化 作用而聚陽離子殼聚糖在pH 7.4時發生去質子化作用。CS/HA-PTX CNPs殼聚糖和HA-PTX 的pKa值分別為6.5和2.1。在pH 1.2（即飯后胃部pH）下，HA-PTX中的大部分羧 基去質子化形成-COOH，CS與HA-PTX的靜電作用較弱，在此pH下形成的聚電 解質復合納米粒很不穩定，容易解體，如圖4-3 A所示。而pH 3.0時，CS/HA-PTX 形成粒徑在200 nm左右的聚電解質復合納米粒，因此，CS/HA-PTX CNPs只能在

21、飯前服用（飯前胃部）CS/HA-PTX CNPs對比不同 pH 條 件下的三條曲線可知，HA-PTX NPs 具有 pH 敏感性。在酸性環境下 pH=3.0， pH=5.0，納米粒的藥物釋放速率要明顯高于在 pH=7.4 的釋放速率。這種現象主 要是由于在低 pH 值下，有利于聚合物材料的降解。HA 與紫杉醇通過酯鍵連接， 酸性條件可以促進酯鍵的水解，從而有利于藥物的釋放。因此，紫杉醇從 HA-PTX NPs 中的釋放在酸性條件下釋放速率要比中性條件快。 CS/HA-PTX CNPsHA-PTX NPs 在 pH 3.0（禁食胃液環境）下兩小時紫杉醇的累計釋放 率大概為 19 %，CS/HA-

22、PTX CNPs 的釋放在 pH 3.0 下兩小時紫杉醇的累計釋放 率大概為 8 %，由此可以看出，聚電解質納米粒外殼富余的殼聚糖可以保護 PTX 在酸性條件不從 HA-PTX NPs 中釋放出來。CS/HA-PTX CNPs圖 4-7 主要是模擬飯前口服給藥的吸收，飯前服用藥物制劑其在胃里的存留 時間大概在兩小時左右，由圖 4-7 可知，在禁食胃液環境中，CS/HA-PTX CNPs 中紫杉醇的累計釋放率大概在 11 %左右，能夠很好的保持紫杉醇的穩定性進而 到達小腸部位。而當其進入小腸部位時，腸液的 pH 值在 6.0-7.0 間，在此時間段 內 CS/HA-PTX CNPs 中紫杉醇的累

23、計釋放率達到 35 %左右根據此線性 關系，測定已知濃度 RB-HA-PTX NPs 溶液的吸光度，可以計算出其中羅丹明 B 的濃度，計算出 RB-HA-PTX NPs 中羅丹明 B 的含量為 5.1 %羅丹明在細胞核和細胞質內均有 分布，并且熒光強度很強，然而進入正常細胞的納米粒相對來說非常少。這主要 是由于癌細胞表現活躍，RB-HA-PTX NPs能夠通過胞吞作用進入癌細胞而只能 通過擴散作用進入正常細胞。胞吞圖 B 與 D 比 較可知，加有游離透明質酸的 RB-HA-PTX NPs 被細胞胞吞的量相對于 RB-HA-PTX NPs 來說明顯降低，說明 B 中增加的游離透明質酸與 RB-H

24、A-PTX NPs 溶液產生了競爭，也就表明透明質酸介導納米粒內吞入胞的有效性。綜上所 述，RB-HA-PTX NPs 進入細胞是通過透明質酸受體介導的并且可以保護 PTX 不 被泵出細胞膜。當空白材料濃度為100 g/mL時，HepG2細胞和NIH-3T3細胞的細胞存活率分別為 93 %和79 %，這充分說明空白材料HA對于HepG2細胞和NIH-3T3細胞來說均具 有良好的生物相容性。圖4-13B為紫杉醇制劑及HA-PTX NPs對HepG2細胞的細胞 存活狀況，結果表明，紫杉醇制劑及HA-PTX NPs對于HepG2細胞具有一定的細 胞毒性，并呈現良好的劑量依賴性熒光成像圖4-15為用RB熒光標記的 口服CS/HA-PTX CNPs和紫杉醇溶液12 h后，各組織藥物的分布情況。口服游離 藥物后，藥物主要分布在肝臟，腎臟、胃部和小腸，在腫瘤部位的分布很少，這 說明直接口服藥物會很快被肝臟及腎臟代謝掉，進入腫瘤部位進而發揮藥效的藥物很少小結二（1）CS/HA-PTX CNPs 在正負電荷比為 2:1 時測得的粒徑約為 120