1、骨髓間充質干細胞治療肺動脈高壓的研究進展來源:創新醫學網肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension, PAH是一組以肺血管阻力持續增加為主要特征的臨床綜合征,其病因和發病機制未明,臨床治療困難,預后較差。近年來隨著分子生物學及細胞生物學的發展,特別是干細胞的研究,給PAH的治療帶來了新的曙光。本文現就骨髓間充質干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs治療PAH的進展進行綜述。1 BMsCs的生物學特性早在1867年,德國科學家Cohnheim發現骨髓中除了造血干細胞以外還有一些非造血干細胞。此后Fried enstein

2、進一步描述了這些呈紡錘狀貼壁生長的細胞,并發現在一定條件下能分化形成類似骨及軟骨的沉積物,這種細胞就是BMSCs1。骨髓中間充質干細胞占有核細胞總數的0.001% 0.010%,并隨年齡的增長而減少,分析間充質干細胞的細胞周期發現,20%為G0期細胞,大多數細胞處于G0/G1期,表明間充質干細胞具有高度的分化潛能。BMSCs既有間質細胞的表面抗原特征,又有內皮細胞、上皮細胞、肌細胞的表面抗原,但不表達造血細胞表面抗原標志(CD14,CD34,CD45,也不表達與人白細胞抗原相關的因子(B7-1,B7-2,人白細胞抗原DR等,缺少特異的表面標志分子。 BMSCs表達的主要分子包括: 黏附分子,如

3、 CD166、CD54、CD1o2、CD44、CD 106等。 生長因子和細胞因子受體,如白介素受體(IL-1R、IL-3R、 IL-4R、IL-6R、IL-7R,y干擾素受體(IFN-yR、腫瘤壞死因子(TNR-等。整合素家族成員,包括CD49、CD29、CD104等。 其他,如C D90、 CD105等2。根據這些單克隆抗原陽性特征,可以對骨髓單個核細胞進行分離純化,得到純度較高的BMSCs。2 BMsCs的多向分化潛能BMSCs在一定條件下可定向分化為骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞、骨髓基質及星形細胞, 另外還可以向外胚層內胚層的細胞分化。Khoo等采用以生長因子刺激為基礎的三階段

4、神經元分化程序 (使用 FGF-2/EGF/PDGF/SHH/FGF-8/ GDNF刺激BMSCs,發現所形成的神經元細胞在形態及基因表達等方面是不成熟的,能夠形成神經球樣結構,并高表達NES及NR4A23。Xing等采用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA作為支架,分離培養大鼠BMSCs,并用5胞苷及0,1umol/L血管緊張素刺激24h后完全培養基培養,形成心肌樣細胞, 表達心肌細胞的標志物抗原肌鈣蛋白I4。Li等將大鼠BMSCs接種于3D PLGA支架,培養3周后發現細胞表達較高水平的肝細胞標志物如白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18、肝細胞核因子及細胞色素P4505。干細胞之所以具有多向分化潛能,與其復

5、雜的調控網絡有關。細胞因子、黏附分子、轉錄因子等因素參與,包括多潛能性轉錄因子Oct4、Nanog和Sox2等,組成復雜的調控網絡來調節與干細胞多潛能性和自我更新相關的分子的表達6。如IL- 17能夠刺激BMSCs表達瘦素7。TGF-1能夠刺激BMSCs向成骨細胞及成軟骨細胞分化,而抑制其向脂肪細胞分化3。另外,表觀遺傳修飾,如組蛋白和DNA甲基化等,可以協同轉錄調節因子來共同維持胚胎干細胞狀態基因的表達。3 BMsCs治療PAH的機制3.1 糾正內皮細胞障礙血管內皮是一種抗血栓形成的半透膜,能夠維持正常血管張力、止血、生長、分化、趨化及創傷修復等。內皮細胞異常及功能障礙對于PAH的形成具有重

6、要作用9。研究表明PAH時內皮細胞受到損傷,凋亡細胞數量增加,同時,由于啟動損傷修復機制,血管平滑肌細胞異常增生,形成PAH的特有損傷叢狀損傷,血管腔狹窄甚至閉塞,血流動力學發生改變。BMSCs移植后在局部微環境的作用下,特別是血管內皮生長因子 (VEGF及流體剪應力等機械刺激的協同作用下向內皮細胞分化10,整合到血管內皮,從而糾正內皮細胞數量異常及功能障礙,這可能是治療PAH的主要機制。然而也有不同聲音,Sahara等采用未分離的骨髓細胞移植治療MCT大鼠加左肺切除的 PAH模型時。雖然見到到達內皮層的細胞是中層的十倍,但還是相當少的細胞整合到內皮層,原因可能是種子細胞的來源不同11,即抑制

7、的是未分離的骨髓細胞。而Rochefort采用同位素示蹤技術發現 BMSCs移植后并沒有定位于肺血管壁,而大部分定位于骨髓12,這提示可能還存在其他機制。3.2 糾正血管舒縮物質比例內皮細胞功能障礙的主要表現就是舒血管物質如No、前列環素與縮血管物質血栓素A2、內皮素和五羥色胺等的比例失衡,調節血管舒縮物質的比例是治療PAH的靶點。前列環素I2 (PGI2是膜磷脂釋放的花生四烯酸的代謝產物,主要由血管內皮細胞產生。PGI2是重要的血管內皮舒張因子,還具有抑制血管中層平滑肌細胞增殖及血小板聚集作用。PG12可以促使內皮細胞釋放NO,而No也能促使P GI2生成增加。 PAH時前列環素合酶(PCS

8、表達降低,PGI2生成減少。Takemiya等研究發現,給野百合堿誘導的 PAH大鼠模型靜脈注射攜帶有PCS基因的 BMSCs后,采用同位素示蹤技術發現BMSCs主要聚集在肺臟,而且治療組肺臟的前列環素水平增高且維持較長時間,治療組100%存活期超過7周, 而對照組僅為38%和44%,能夠明顯改善PAH的預后13。3.3 糾正鉀離子通道的異常,抑制平滑肌細胞增生鉀離子通道是一種高度選擇性的蛋白通道,共有 4種類型:鈣活化型鉀離子通道、內向性整流型鉀離子通道、串聯孔域型鉀離子通道及電壓依賴型鉀離子通道(v oltage dependent K+ challnel,Kv。其中 Kv是目前研究最多的

9、一種。Kv對于維持膜電位以及調節細胞內游離鈣離子濃度具有重要意義,抑制 Kv會導致細胞膜電位升高而去極化,激活電壓門控鈣離子通道,使鈣離子進人細胞內而導致血管收縮、平滑肌細胞增殖,并且抑制其凋亡14-15。特發性 PAH患者與繼發性P AH患者相比,其肺動脈平滑肌細胞Kv明顯受到抑制,從而細胞鈣離子內流增多,使肺動脈收縮加強,平滑肌細胞增殖1161。在減肥藥右旋酚氟拉明誘發的PAH中,發現不僅僅是平滑肌細胞,巨核細胞也同樣存在Kv缺陷,這種缺陷導致血小板釋放五羥色胺增多,再攝取減少,從而引起血管張力的增高17。缺氧可抑制肺阻力血管平滑肌細胞的Kv,導致鈣離子通道開放增加,從而引起缺氧性肺血管收

10、縮及平滑肌細胞增殖,改善Kv 功能能夠抑制PAH的發展18。研究表明利用腺病毒轉染的survivin磷酸化缺陷基因能夠增加鉀離子通道的表達,抑制PAH的形成19,而采用載有 survivin磷酸化缺陷基因的BMSCs則可能會通過增加鉀離子通道的表達而起作用。也有研究表明, 轉載有腎上腺髓質素基因的內皮祖細胞 (endothelium progenitorce lls,EPCs移植較單獨移植EPCs更有效的抑制野百合堿誘導的PAH20。3.4 抑制炎癥反應目前認為多種細胞因子參與的炎癥機制是PAH發生的重要原因。缺氧、自身抗體、病原微生物等多種因素可以導致促炎因子表達升高,激活炎癥細胞和下游的信

11、號轉導通路,啟動平滑肌細胞及成纖維細胞的增殖過程和炎性病變, 進而引起微血管管腔變狹與閉塞,形成PAH。干細胞移植可以抑制促炎因子的釋放,抑制炎癥反應,調節血管對血管活性物質的反應性21,從而抑制 PAH的形成。3.5 補充內源性EPCs 循環中EPCs是一小群來源于骨髓的干細胞,能夠隨著血液循環到達血管內皮,對于修復損傷的內皮細胞具有重要意義。大量研究表明PAH時EPCs明顯減少,而去除循環中 EPCs時則可能會發生肺間質纖維化和PAHE222-24。移植BMSCs后可能會增加循環中的EPCs,從而達到抑制PAH的形成。這已經在體外實驗中得到證實。Zhao等取骨髓來源的單個核細胞,采用內皮培

12、養基培養710d后呈現典型的內皮細胞樣改變, 包括細胞呈鋪路石樣排列,并表達內皮細胞標記物, 如Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白,荊豆凝集素,血管假性血友病因子和胎兒肝激酶1(Flk-1,表達率高達65%83%25。Raida等采用重組人骨形成蛋白2(rhBMP-2刺激BMSCs后發現VEGF及胎盤生長因子表達明顯增加,用培養BMSCs的細胞培養液上清刺激EPCs則能引起EPCs明顯增殖, 單用rhBMR2刺激EPCs則不能引起其增殖,但可引起其趨化性增強。這提示BMR2可能通過刺激 BMSCs分泌一些生長因子來誘導EPS增殖及趨化的。3.6 促使新生血管形成肺微循環血管閉塞、血管床減少是PAH

13、的重要原因之一。BSMCs移植后可能通過產生血管生長因子等來刺激新生血管形成,從而改善肺微循環,達到降低肺動脈壓的目的。新生血管的形成是一種復雜的過程,是多種分子與細胞相互作用的結果,不僅包括內皮細胞、循環中的內皮祖細胞,還包括VEGF、BMP2、ICAM等, BSMCs移植可以修復內皮細胞損傷,并通過分泌細胞因子及生長因子等引起血管新生, Sanz等26的研究表明了這一點。Duffy等發現,在血管形成的早期,BMSCs能夠刺激內皮細胞的增殖、遷移,降低內皮細胞的通透性,且這種作用呈現時間-劑量依賴關系。提示BMSCs在新生血管形成、穩定與成熟方面發揮著重要的作用27。4 BMSCs治療PAH

14、的臨床應用我國浙江醫科大學第一附屬醫院的Wang 等28選擇特發性PAH患者31例,診斷依據臨床評估、右心導管、超聲心動圖、螺旋CT、肺血管造影、及肺通氣灌注掃描、肺功能測試,心功能NYHA2-3級,平均肺動脈壓力大于30mmHg、6分鐘步行距離測試大于等于50m。每例患者抽取250ml外周血,通過Ficoll密度梯度離心法獲取單個核細胞,培養在纖連接蛋白包被的培養皿中,采用含20%人血清及血管內皮生長因子50ng/ml的M199培養基進行培養。5d后90%的細胞顯示DiI-acLDL陽性。31例患者隨機分為治療組與對照組,治療組在傳統治療的基礎上以(1.1± 0.6× 1

15、07個細胞制成 10ml細胞懸液靜脈注人,共16例;對照組15例進行傳統治療。隨訪12周,治療組組6分鐘步行距離平均增加48.2m,而對照組增加5.7m,兩組之間差別顯著。治療組平均肺動脈壓、肺血管阻力和心輸出量明顯改善,且未發生嚴重事件。該研究顯示靜脈注射自體EPCs細胞是可行的、安全的,并且具有增加IPAH患者運動能力和改善肺動脈血流動力學的益處。此后,Patel等29報道了2例,其中一例是44歲高加索人,慢阻肺合并PAH患者,接受干細胞移植后在數天內癥狀改善明顯,然而隨后數月內逐漸惡化,盡管癥狀逐漸惡化,他的6分鐘步行距離及心臟彩超檢查結果均保持較移植前改善狀態,2 年后準各接受再次移植。另一例是78歲老年高加索男性,慢阻肺合并PAH患者,接受干細胞移植后癥狀并無明顯改善,但移植3個月后彩超檢查右心舒張末壓41mmHg,較基礎55mm Hg明顯減低, 隨訪一年無明顯變化。這與Zhao等報道的結果明顯不同,由于臨床報道較少,具體原因有待于繼續觀察。eward等報道8例嬰兒惡性骨硬化癥患者同種異體干細胞移植后并發重度PAHE3。彐,G gg等也報道1例36歲女性移植物抗宿主反應患者發生 PAH31,這也為干細胞移植的安全性提出了挑戰。5 問題與展望盡管近年來對BMSCs的研究取得了很大進展,但仍然存在以下問題尚待解決: 目前很多結果均來自動物實驗,臨床數據較少且結果不一,