1、膿汁和糞便標本中病原菌的檢測 年級專業：14臨床輸血 學號： 3140704004 姓名：寧立軍 組別： 第七組 合作者：牛愷文 黃可秀 朱晉輝 實驗室：第六實驗室 指導老師：羅軍 實驗的得分：一、實驗目的 通過革蘭氏染色并在油鏡下觀察細菌形態結構、細菌的生化反應和細菌的血清學反應等手段區別和鑒定膿汁標本中和糞便標本中細菌，檢測病原微生物，并進行細菌藥物敏感性試驗。二、實驗器材1器材 接種環 接種針 打火機 馬克筆 酒精燈 電熱恒溫培養箱 物顯微鏡 電爐 試管（帶棉塞） 稱量紙 藥勺 牛皮紙 橡皮筋 尺子 錐形瓶 高壓蒸汽滅菌器 鑷子 玻片 吸水紙 2 試劑藥品 普通營養瓊脂培養基 蒸餾水 膿

2、汁標本 糞便標本 石蠟油 生理鹽水 結晶紫 盧戈碘液 95%乙醇 稀釋復紅 葡萄糖微量發酵管（2支） 乳糖微量發酵管（2支） 青霉素抗菌素紙片 鏈霉素抗菌素紙片 慶大霉素抗菌素紙片 兔血漿 福氏志賀菌診斷血清三、方法與步驟1培養基制備 稱取一定量的肉湯培養基，至于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，煮沸一次，趁熱分裝；稱取一定量的營養瓊脂培養基，至于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，煮沸三次（煮至剛剛冒泡，立刻置于臺面，半分鐘后再煮），使完全溶解，趁熱分裝。（平板培養基：以無菌操作，傾注平皿10ml，瓊脂完全凝固后，平板倒放，4冰箱保存備用。斜面培養基：培養基趁熱斜放，培基不超過試管長度的2/3，瓊脂凝

3、固以后，4冰箱保存備用。）貼上標簽后滅菌使用。2空氣與人體體表細菌學檢查根據空氣中細菌氣溶膠粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培養基表面，培養以后，計數菌落形成單位（CFU），了解空氣的污染情況。平板蓋打開，蓋朝下放在平板旁，瓊脂平板暴露15分鐘即可。 在普通平板上接種手指上的細菌。第1格為洗手前，第2格為洗手后，第3格為消毒后，第4格空白對照。 3細菌分離培養 接種前，接種環燒灼滅菌。取標本在平板表面上方密集涂布510 mm。燒掉接種環上多余的標本。冷卻后，應用分區劃線分離法，將膿汁標本接種于營養瓊脂平板（2份），糞便標本接種于伊紅美藍平板（2份）。接種完畢后，接種環燒灼滅菌。

4、將平板倒置37培養1824h,觀察結果 。4細菌的群體生長特性觀察和純化培養 觀察細菌分離培養物中菌落特征，并記錄。選取平板上相同的菌落數多的，典型的，容易挑取的單菌落。通過無菌操作輕刮取菌，接種于斜面培養基中。接種完畢，灼燒接種環，斜面培養基置于37培養過夜。5細菌的個體形態特征的觀察 斜面培養物的觀察革蘭氏染色：取潔凈載玻片，用滅菌操作后的接種環取生理鹽水1-2環于玻片上，挑取細菌培養物少許與鹽水輕輕抹勻。待涂片干燥后在酒精燈火焰外側快速來回2-3回合，使標本固定，進行染色。結晶紫染液初染1分鐘后水洗，蘆戈氏碘液媒染一分鐘后水洗，95%酒精脫色20-30s，水洗，稀釋復紅復染一分鐘后水洗。

5、待標本晾干后滴加香柏油，油鏡下觀察。通過無菌操作，分別在斜面培養物中挑取菌苔少許，立即移入肉湯培養基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調和，使菌液混合語培養基中，混勻。接種完畢，試管口通過火焰2-3次滅菌，塞好棉塞。接種環灼燒后放下。6細菌的糖發酵實驗 通過無菌操作，用滅菌接種針刮取新鮮細菌培養物少許，分別接種在葡萄糖發酵微量管中和乳糖發酵微量管內。將微量管平放在平皿內，37培養過夜后觀察結果。7血漿凝固酶實驗 取干凈玻片一張，在左右兩邊分別滴加兔血漿1-2滴，生理鹽水1滴。將接種環在酒精燈火焰上灼燒滅菌冷卻后，取細菌新鮮培養物少許，在生理鹽水中研磨混勻成細菌懸液。用滅菌接種環取

6、細菌懸液1環，或挑取細菌培養物少許，在兔血漿中輕輕抹勻。稍等片刻，觀察結果。8血清學實驗 取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設為對照區，滴加生理鹽水15ul。遠端設為試驗區，滴加福氏志賀菌診斷血清15ul，用接種環分別取粉紅色菌苔，研磨于鹽水或血清內，混合均勻。載玻片來回傾側，讓菌液充分混勻，凝集速度更快、結果更清楚。9半固體穿刺培養 接種針滅菌處理后挑取菌苔少許，垂直刺入半固體培養基中心，可刺達近底管處，但不要到達管底，然后沿原路退出。接種完畢，試管口迅速通過火焰2-3次滅菌，塞好棉塞。接種針灼燒后放下。37培養過夜。10細菌藥物敏感性試驗 接種環取菌液在平板培養基表面，拉出2條細菌接種線，使呈

7、“十字形”。平板密集劃線接種細菌。設計三點，呈等邊三角距離，點距離平皿邊緣約15mm。作標記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應的藥物紙片，平貼在已設定的位置上，按壓，鑷子火焰滅菌。371824小時培養，觀察結果。四、實驗結果及分析1、空氣與人體體表細菌學檢查（1）空氣：菌落數：16個，采集地點：廁所。由CFU /m3 50,000NAT 86N(直徑7cm平板）實驗室空氣細菌標準。N：平板上的菌落數，A：平板面積(38.5cm2)，T：采樣時間(15分鐘)分析討論：在課堂上，和其他組比較發現，微生物實驗室中空氣細菌是比較多的，而廁所反而菌落少，可能是因為實驗室是封閉的，而且人流量大，故而空氣

8、中的細菌也就多了，廁所人流量少，反而干凈。（2）人體體表：手指皮膚的細菌學檢查我們發現無論是標準還是普通洗手后，平板上菌落的數量與洗手前的是差不多的，甚至還多些，而消毒后的我們組兩個同學的沒發現菌落，空白對照出有兩個同學的都有一個菌苔洗前細菌種類多，洗后細菌種類少。分析討論：對于普通洗手的同學來說，由于暫駐細菌未能完全清洗干凈，而常駐細菌又暴露了，故洗手后測到的細菌反而多了，對于標準洗手的同學來說，暫駐細菌可能是完全洗凈，但暴露的常駐細菌可能與暫駐細菌相當或比之還多，因此出現該結果。而用碘酒消毒后未發現菌落，說明碘酒消毒可以消毒徹底。而空白對照說明我們手指皮膚上的細菌比空氣中的多。2細菌分離培

9、養 濃汁標本平板 糞便標本平板膿汁標本在普通平板上有黃色、白色兩種菌落，圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、不透明。糞便標本在伊紅美藍平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落。紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明。淡粉紅色菌落半透明。分析討論：用伊紅美藍平板，從糞便標本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產生是因為乳糖被分解產酸，酸使伊紅美和藍紫結合，產生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。3細菌的個體形態特征的觀察 G-桿菌 G+球菌 分析討論：用伊

10、紅美藍平板,從糞便標本分離，獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列。用普通平板，從膿汁標本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規則，呈葡萄串狀。4細菌的糖發酵實驗分析討論：糞便標本分離菌糖發酵試驗中，紫黑色菌落菌種的葡萄糖和乳糖微量發酵管都為黃色，有氣體產生；粉紅色菌落菌種的葡萄糖微量發酵管為黃色，不產氣，乳糖微量發酵管無明顯變化。5血漿凝固酶實驗膿汁標本分離菌血漿凝固酶實驗中，黃色菌種菌液出現明顯凝塊，實驗結果為陽性；白色菌種未出現凝集反應，實驗結果為陰性。分析討論：通過血漿凝固酶實驗，黃色菌種實驗結果為陽性，為致病菌。6血清

11、學實驗玻片凝集試驗中，粉紅色菌落菌種在福氏志賀菌診斷血清中出現片狀凝集現象，實驗結果為陽性；而在生理鹽水中未出現凝集現象。分析討論：通過血清學實驗，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發生凝集反應，確定其為福氏志賀菌。7半固體穿刺培養 半固體培養基中，紫黑色菌落菌種擴散生長，培養基呈擴散云霧混沌狀態；粉紅色菌落菌種沿穿刺線生長，穿刺線邊緣整齊，周圍培養基清澈透明。分析討論：半固體動力試驗表明紫黑色菌落菌種半固體動力試驗結果陽性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動力試驗結果陰性，無鞭毛。8細菌藥物敏感性試驗 白色細菌平板 黃色細菌平板 粉紅色菌種平板 紫黑色菌種平板各菌落抑菌圈直徑青霉素頭孢曲松慶大霉

12、素黃色菌種42mm25mm30mm白色菌種30mm22mm40mm紫黑色菌種無作用37mm26mm粉紅色菌種無作用36mm38mm分析討論：由于青霉素針對的是革蘭氏陽性細菌，因此對白色菌落和黃色菌落是高度敏感的，而頭孢曲松和慶大霉素都是廣譜抗生素，對革蘭氏陰性和陽性細菌都較為敏感，因此對四種菌落都有較好的抑菌作用，這也說明我們不能單從這些細菌的抗藥敏性實驗中得出細菌的種屬，應結合多個生化反應進行判斷。五、實驗綜合討論1、用普通平板，從膿汁標本中分離得到黃色、白色兩種菌落，油鏡下均為G+球菌，排列不規則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結合菌落色素，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌

13、。致病性葡萄球菌能產生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉變為不溶性纖維蛋白,附著于菌體表面,形成凝塊。通過血漿凝固酶實驗，金黃色葡萄球菌實驗結果陽性，為致病菌。用伊紅美藍平板，從糞便標本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產生是因為乳糖被分解產酸，酸使伊紅美和藍紫結合，產生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。從形態上不能鑒別是什么細菌。經糖發酵試驗（紫黑色菌落菌種分解葡萄糖和乳糖，產酸產氣；粉紅色菌落菌種只能分解葡萄糖，產酸不產氣）半固體動力試

14、驗（紫黑色菌落菌種半固體動力試驗結果陽性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動力試驗結果陰性，無鞭毛）。對照常見腸道感染細菌主要生化反應特征，判定它們分別是大腸埃希菌和福氏志賀菌。通過血清學實驗，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發生凝集反應，進一步確定其為福氏志賀菌。腸道桿菌科各菌屬生化反應鑒別表葡萄糖乳糖麥芽糖甘露醇蔗糖半固體埃希菌屬+志賀菌屬+/-/+-沙門菌屬/+-+霍亂弧菌+-+變形桿菌屬-+注： + 產酸或陽性， 產酸產氣，- 陰性，+/- 多數陽性， -/+ 多數陰性 不確定。常見腸道感染細菌主要生化反應特征葡萄糖乳糖半固體大腸埃希菌+福氏志賀菌+傷寒沙門菌+霍亂弧菌+幽門螺桿菌不分解糖類+變形桿菌+2、對照常用藥敏試驗紙片判斷標準，金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌對青霉素、慶大霉素、鏈霉素均敏感。大腸埃希菌對青霉素耐藥，慶大霉素、鏈霉素敏感，福氏志賀菌對青霉素耐藥，對慶大霉素、鏈霉素敏感。可得結論G+球菌對青霉素和鏈霉素敏感。 G-桿菌對青霉素耐藥，對鏈霉素敏感。G+球菌和G-桿菌對廣譜抗菌素慶大霉素都