1、微流控芯片中的分離與富集姓名：鄒振 學號：S10222012 專業：生物醫學工程（湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，長沙，410082）摘要 本文綜述了微流控芯片中的分離與富集的方法。這些技術的發展也為試樣前處理的進一步發展提供了新的機遇。與常規分離技術相比，微流控芯片分離技術由于具有較大的比界面面積和較短的擴散距離，因而系統具有較高的分離效率和較快的分析速度。而最近一些基于場效應的微流控分離富集分析系統的建立，更為微流控芯片中的分離與富集提供了新的理論基礎和應用應用價值。關鍵詞 微流控芯片 分離 富集 多相層流 場效應自1990年由瑞士的Manz和widme提出微全分析系統1的概念

2、以來，微流控分析技術到現在十幾年的時間里己經取得了極大的發展。“微全分析系統”或“芯片實驗室”是指通過化學分析設備的微型化與集成化，最大限度地將分析實驗室的功能轉移到便攜設備中，甚至集成于方寸大小的芯片上。這就對試樣的前處理步驟提出了較高的要求，需要對微量的試樣自動完成檢測前的前處理操作，如混合2、反應3、分離(如液-液萃取4-7、固相萃取8-9、過濾10和滲析11等)、濃集、稀釋等。微流控技術的發展也為試樣前處理的進一步發展提供了新的機遇。在微系統通道中，出現一系列不同于宏觀體系的尺度效應，如微通道中表面張力的影響遠大于重力因素，基于擴散的傳質效應顯著等，在微通道內流體總是表現為穩定的層流狀

3、態，以及較短的擴散距離和擴散時間。這些不同于宏觀體系的特點，導致了許多不同于常規方法的微流控無膜分離技術的產生，如無膜液-液萃取和無膜多相層流分離技術。與常規分離技術相比，微流控芯片分離技術由于具有較大的比界面面積和較短的擴散距離，因而系統具有較高的分離效率和較快的分析速度。1.微流控芯片的多相層流無膜擴散分離1.1多相層流擴散芯片構型利用多層流不但可以實現小分子、離子與大分子、微粒之間的分離，若采用適當的檢測方式，還可以在分離的同時直接進行檢測。Yager5等提出了H-過濾系統和T-傳感器兩種系統，前者用于試樣的進化、提取，后者在試樣的進化、提取同時進行反應及測定。另外還有“Y”型12,以及

4、復雜的網絡型13-15、二維通道16-17、三維通道18等。圖1為H-過濾系統，由試樣流和接受流組成，在重力或微注射泵的推動下，接受液和試樣液分別從各自的進樣口進入并會合于主通道，以肩并肩生物方式平行流過主通道。由于小分子擴散快，大分子和微粒擴散慢，因此，在一定時間內只有小分子物質可以擴散進入接受液（被接受液提取），最后可分別在流出口處收集含提取物的接受液和除去提取物后的試樣液。圖1. H-過濾系統如圖2（a）所示，在T-傳感器5中，試樣液和試劑溶液(如酸堿指示劑19、熒光標記試劑20、抗體21-25等)在重力或微注射泵的推動下，從各自的進樣口進入并會合于主通道，以肩并肩生物方式平行流過主通道

5、。由于小分子擴散快，大分子和微粒擴散慢，試樣中的待測組分如H離子，鈉離子等小分子，快速進入試劑相并在界面發生反應，利用兩相界面間試劑顏色的變化等，可定量測定待測組分的含量。（a） （b）圖2.（a）T-傳感器;（b）用于細胞裂解和胞內成分分析的芯片1.2多相層流無膜分離技術的特點（1）利用多相層流內物質間擴散速度的差異，實現小分子、離子與大分子、微粒的分離，因此對于混濁液和復雜試樣如血，可不必進行離心、過濾等預分離而直接進行檢測;（2）檢測反應可在擴散的界面進行，也可在多相層流分離的下游通道內進行;（3）多相層流間的擴散可給出關于流速、試樣粘度、試樣濃度、分子量等信息，據此可建立測定試樣中待測

6、組分的濃度、擴散系數、分子量和流體粘度的分析方法;（4）可實現多相層流操作的多路并行分離分析，在單一通道中分離分析兩個或兩個以上的不同試樣。也用參比液與試樣液平行地在同一通道中流過，實現實時自參比，消除由于流體、幾何形狀、溫度、檢測器光源等變化而引起的誤差。（5）層流擴散主通道既是分離通道又是檢測通道，在流體流動方向的不同位置測得的信號強度可提供有關反應動力學的信息.。2.微流控芯片中的液-液萃取分離液一液萃取又稱溶劑萃取，是利用物質在互不相溶的兩相中分配比不同而達到分離的目的。在宏觀體系中，液一液萃取通常是將有機溶劑(即萃取劑)和含有待分離組分的試樣水溶液振蕩混合，使兩相充分接觸，試樣中的分

7、析物就會在兩相之間進行分配。分配達到平衡后，利用兩相密度差異將有機相與水相分層分離。通常把物質從水相進入有機相的過程稱為萃取，而相反的過程稱為反萃取。萃取分離法的優點是分離效果好;通過多次萃取，可以達到很高的回收率;萃取所需設備簡單，操作簡便，適用范圍廣。它不僅適用于常量組分的分離，也適用于微量組分的分離濃集;不僅適用于實驗室少量試樣的分離，而且適用于工業生產中大量物質的分離和純化。萃取分離法的缺點是采用手工操作時，工作量較大;試劑用量大;所采用的溶劑往往是易燃、易揮發和有一定毒性的物質，這對操作者和實驗室的安全是不利的;且通常有機溶劑價格較高，因此在應用上受到一定限制。另外，經過劇烈振蕩易導

8、致乳化現象，使分相困難。一般需采用增大有機溶劑的用量，加入電解質，改變溶液酸度，避免劇烈振蕩等方法，來降低或消除乳化現象。Kitamaori7等在Yager等多相層流無膜擴散分離技術的基礎上建立了芯片上的微流控液液萃取分離系統。雖然微流控液液萃取分離也是通過層流條件下的分子擴散實現組分的相間轉移，但兩者的分離原理不同。多相層流無膜擴散分離技術是基于物質擴散速度的不同，實現小分子、離子與大分子、微粒間的分離，液液萃取則是基于物質在互不相溶的兩相間分配比的不同而控制溶液中組分的傳質。在微流控液液萃取系統中通過對兩種互不相溶的溶劑流動相流量的調節，可以在微通道中形成超薄的有機膜，在分離的選擇性、速度

9、、富集倍率等方面較單純水溶液的多相層流無膜擴散分離有明顯的優勢。在液一液萃取中待測物由其中一相轉入另一相總是穿過兩相間界面完成的。在傳統的手工間歇操作中通過激烈振蕩形成兩相間的高度分散，以盡量擴大兩相間的界面面積來提高轉移效率。在微米級通道中，兩相間有很大的比表面，因此無需機械振蕩就可取得很高的萃取效率。Kitamaori5等通過實驗研究表明，在微流控芯片中，萃取時間受制于分子擴散速率。影響層流萃取效率的主要因素有: 流速、比表面大小、擴散距離、反應速度等。與常規流動萃取法相比，微流控層流萃取分離因為萃取操作在微米尺度的微通道中進行，因此具有如下獨特的優點:1.在微米級通道中兩互不相溶的溶劑處

10、于平穩的層流狀態，無需相分隔即可保持兩相連續的接觸，實現相轉移，也無需相分離器，即可在線檢測；2.微米通道中短距擴散和大的界面/體積比縮短了萃取時間。萃取效率高。在微通道中形成超薄有機膜，溶質擴散時間僅需數秒至數十秒；3.溶劑和試樣用量小(l00nL)；4.在同一芯片中可集成萃取、反萃取等多個化學操作單元。如圖3所示的芯片中集成了八個化學操作單元，包括:兩相的形成、混合和反應、萃取、相分離、三相的形成、共存物的分解、金屬離子的除去、鰲合劑的除去等。圖3.利用微流控芯片分離檢測鈷離子的示意圖263.微流控芯片中的滲析分離滲析也稱透析，主要是用于諸如蛋白質，激素及酶這一類物質的濃縮，脫鹽和純化。分

11、離的基礎是離子或小分子從半透膜的一側液相（供體相）轉入另一側液相（受體相）的遷移率之差。起到區分作用的是選擇性薄膜，想轉移的推動力是膜兩側中組分的濃度梯度。滲析是一種較緩慢的過程。而在微流控芯片中，滲析所需要的時間會大大減小。除此以外，在微流控芯片中的滲析還有試樣消耗量少、污染小、可直接與各類分析儀器聯用27-29、在復雜生物試樣分析時，有利于減小干擾等優點。圖4為“三明治”結構的微流控滲析系統。試樣由小管通入，滲析液由大管通入，可以實現小分子和大分子的快速高效分離。圖4.“三明治”結構的微流控滲析系統4.微流控芯片中的固相萃取分離富集4.1微流控固相萃取技術的優點和操作過程固相萃取利用選擇性

12、吸附與選擇性洗脫的分離原理,可實現樣品的分離、純化和富集。利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附,與樣品的基體和干擾化合物分離,再選用適當的溶劑沖去雜質,然后用少量溶劑迅速洗脫,從而達到快速分離和富集目標化合物的目的。與宏觀體系中固相萃取不同的是,在微流控芯片系統中,由于微體系的縮微化,大大減小了樣品及試劑的用量,縮短了萃取所需要的時間,提高了萃取效率。在微流控芯片系統中實現固相萃取,操作過程一般分為4步:(1)活化吸附劑:在萃取樣品之前用適當的緩沖液流過吸附劑,使其保持濕潤或恢復活性,以便吸附目標化合物;(2)進樣:樣品通過電驅動或壓力驅動等形式流過吸附劑;(3)緩沖液平衡吸附劑: 利用

13、緩沖液將殘留在微通道中的試樣逐出分析系統;(4)洗脫待測物:用少量溶劑迅速將待測物從吸附劑上洗脫下來,進行后續的分析操作。固相萃取的效能從本質上講取決于吸附劑的結構和性能。體現為對復雜樣品體系分離能力的高低以及獲得的富集倍數的大小。4.2微流控芯片系統固相萃取的分類在微流控芯片系統中,按照存在形式的不同,固相萃取可分為開口管吸附劑30、填充柱31和整體柱3種類型。基于開管式吸附劑的制備通常是將固定相以液體狀態充入芯片微通道中,含有所需功能團的固定相通過涂漬、鍵合等方法結合到微通道內壁從而形成開管式固相萃取吸附劑。為了獲得性能優異的通道表面以實現對目標分析物高選擇性的分離富集, 對各種表面修飾材

14、料的研究成為一個重點。聚硅烷31-34、聚酰胺35、樹脂等被廣泛用作修飾的材料;將蛋白質36-39、酶等生物分子固定在微通道表面作為固相萃取的吸附劑也是一種新的方法。圖5為微流控血液蛋白分離分析系統40。其基本原理就是將一抗固定在微通道表面,當蛋白質通過側通道進入，就與特異性的蛋白結合，并于通道中的標記有熒光基團的二抗結合。通過成像即可判斷血液中蛋白的成分。該方法檢測所需血液量只要一滴，并大大縮短了檢測時間。圖5.微流控血液蛋白分離分析系統利用填充式吸附劑進行分離富集的操作過程為:首先通過微加工技術直接在芯片通道中形成圍堰、柵欄、壩等微結構以作為固定相填充床,再將硅膠、微珠等顆粒通過電驅動或壓

15、力驅動引入填充床作為固相萃取吸附劑,然后對試樣中目標物進行分離富集。與開管式固相萃取相比,填充式固相萃取能獲得更大的比表面積,有利于提高對目標物的分離富集效率。Andersson41等提出了用于固定填充劑的微結構設計應滿足的要求,即:對流動相有較小的流體阻力;能有效截留雜質微粒;體積應相對集中以便于檢測。他們在微流控芯片系統中設計了如圖6所示的3種不同形狀的過濾器,對三者性能進行了比較后認為,c形填充結構能夠獲得較小的流體阻力,較高的吸附容量,而不影響檢測靈敏度。圖6.固定填充劑的微結構示意圖整體柱吸附劑是近幾年在微流控體系中發展起來的一種新型固相萃取吸附劑,它通過聚合物單體在微通道內發生原位

16、聚合反應而制得,具有結構均勻、可獲得較大比表面積的吸附表面等優點(如圖7所示)。另外它還具備優異的通透性、高空間利用率、制備過程簡單等優點。原位聚合反應制備整體柱避免了在微通道中填充固定相的困難以及高精度的微結構加工技術的需要。圖7.芯片上的整體固定相結構圖在微流控芯片系統中進行非均相免疫分析是一種非常重要的分析方法。將抗體固定在固體表面,這是在微流控芯片系統中進行非均相免疫分析最關鍵的步驟。其中,通過在微珠表面固定抗體,再將其填充到芯片的通道中,對抗原進行吸附富集,是一種重要的分離富集方法。常用的微珠有聚苯乙烯微珠、瓊脂凝膠微珠及磁性微珠等。圖8為微流控蛋白aptamer篩選系統42。其大致

17、原理為先把目標蛋白固定在磁珠上，然后與DNA文庫雜交。利用磁場將與蛋白結合的DNA與未結合的DNA分離。圖8.微流控蛋白aptamer篩選系統5.微流控芯片中的電泳分離富集微芯片毛細管電泳分離分析的基本原理與常規毛細管電泳相似，但是在平面芯片的微細通道中進行高效、快速的電泳分離分析尤其特殊。毛細管電泳指以高壓直流電場為驅動力，以20一200µm內徑的毛細管為分離通道，依據樣品中各組分的多種特性(電荷、大小、等電點、極性、親和行為、相分配特性等)為依據的液相微分離技術。在一定的pH條件下，石英毛細管內壁的硅輕基發生電離，帶負電荷，從而與電泳緩沖液形成了雙電層。在分離過程中采用了高電壓，

18、雙電層的水和陽離子向著負極方向遷移，由于毛細管極細，在溶液毛細張力的作用下，水合陽離子的遷移會引起管內流體整體朝著負極方向移動，形成電滲流(EOF)。而待分離的離子則根據電荷情況的不同在緩沖液中產生電泳運動。在電泳分離中，還有芯片介電電泳分離和芯片自由流電泳分離兩類。芯片介電電泳分離是利用任何材料都有都有一定的介電特性，在外加電場的作用下，會受到一定的極化，如果外加電場的空間分布不均勻，這些被極化了的微粒就會受到一定的進凈力，即介電泳力4349，而造成不同程度的漂移運動，從而達到分離的目的。圖9.介電泳的基本原理及微流控細胞分離富集系統自由流電泳(free-flow electrophores

19、is,FFE)是20世紀五六十年代提出的一種半制備型分離技術,因其分離條件溫和、分離模式多樣、連續分離以及無固體支持介質等特點,得到人們的廣泛關注。自由流電泳的基本原理是:在上下兩塊平行板之間構成的一個薄的矩形分離腔室中,待分析樣品通過載體電解質溶液向前流動,在流體垂直方向施加分離電壓,隨著時間的推移,帶電荷樣品根據其電荷不同,在分離腔室中形成數個分散區帶,在裝置出口處收集得以分離。6.微流控芯片中的其它分離富集方法6.1基于外場效應的分離近年來，基于場效應發展起來的微流控分離富集技術越來越多。圖10（a）是利用場效應分離的基本原理示意圖。如圖所示，不同的粒子在電場49、磁場4244-46、聲

20、場47-49、光場50-52等外加場的條件下，它們的受力等發生變化，使運動軌跡發生改變。從而達到分離的目的。（a）（b） （c）（d） （e）圖10.基于場效應的微流控分析系統。（a）場效應分離總示意圖（b）基于磁場分離不同的磁性微粒；（c）利用不同粒子在超聲情況下的擴散不同實現粒子的分離；（d）基于光場分離不同的光敏性微粒；（d）基于電場分離不同的微粒總 結本文介紹了微流控芯片中的分離與富集的基本技術。這些技術的發展也為試樣前處理的進一步發展提供了新的機遇。與常規分離技術相比，微流控芯片分離技術由于具有較大的比界面面積和較短的擴散距離，因而系統具有較高的分離效率和較快的分析速度。而最近一些基

21、于場效應的微流控分離富集分析系統的建立，更為微流控芯片中的分離與富集提供了新的理論基礎和應用應用價值。參考文獻1Manz,A.;Grbaer,N.;Widmer, M.Sens.Actuators B1990,1,244-2482Reyes,D.R.;Iossifidis,D.;Auroux,P.-A.;Manz,A. Anal.Chem. 2002,74 (12), 26232636.3Auroux,P.-A.;Iossifidis,D.;Reyes,D.R.;Manz,A. Anal.Chem. 2002, 74 (12), 26372652.4H.R.Hulett,W.A.Bonner,

22、J.Barrett and L.A.Herzenberg, Science, 1969, 166, 7477495方肇倫(Fang Z L).微流控分析芯片(Microfluidic Analytical Chips).北京:科學出版社(Beijing:Science Press),2003.116Giordano N ,Cheng J T.J.Phys. Condensed Matters ,2001 , 13(15):R271 R2957 方群(Fang Q),陳宏(Chen H),蔡增軒(Cai Z X) . 高等學校化學學報(Chemical Journal of Chinese Un

23、iversities) , 2004 , 25 : 261 2638Reyes D R , Iossifidis D , Auroux P A , Manz A. Anal.Chem., 2002 , 74 (12) : 2623 26369 Auroux P A ,Iossifidis D , Reyes D R , Manz A. Anal.Chem., 2002 , 74 (12) : 2637 265210 Paegel B M, Yeung S H I , Mathies R A. Anal.Chem.,2002 , 74(19):5092509811Rice,J.J.;Daughe

24、rty, P. S. Protein Eng. Des. Sel.2008,21, 435442.12West,J.;Becker,M.;Tombrink,S.;Manz,A.Anal.Chem. 2008,80 (12),44034419.13Huang, G.;Mei, Y.;Thurmer, D. J.;Coric,E.;Schmidt,O.G.Lab Chip 2009, 9(2), 26326814Hsieh, C.-C.; Huang, S.-B.; Wu, P.-C.; Shieh, D.-B.;Lee, G.-B. Biomed. Microdevices 2009, 11 (

25、4), 90391315Gottschamel, J.; Richter, L.; Mak, A.; Jungreuthmayer, C.; Birnbaumer,G.; Milnera, M.; Bruckl, H.; Ertl, P. Anal. Chem. 2009, 81 (20), 85038512.16 Hosokawa K, Fujii T, Endo I. Anal.Chem.,1999 ,71(20): 4781 478517 Park, E. S.; Brown, A. C.; DiFeo, M. A.; Barker, T. H.; Lu, H. Lab Chip 201

26、0, 10 (5), 57158018 Rubakhin, S. S.; Churchill, J. D.; Greenough, W. T.; Sweedler, J. V. Anal.Chem. 2006, 78, 72677272.19Putnam, A. J.; Jeon, N. L. Lab Chip 2009, 9 (12), 1740174820 Dittami, G. M.; Rabbitt, R. D. Lab Chip 2010, 10 (1), 303521 Chen, C.; Skog, J.; Hsu, C.-H.; Lessard, R. T.; Balaj, L.

27、; Wurdinger, T.;Carter, B. S.; Breakefield, X. O.; Toner, M.; Irimia, D. Lab Chip 2010, 10(4), 505511.22 Jang, K.-J.; Suh, K. Y. Lab Chip 2010, 10 (1), 3642.23 Xu Y, Bessoth F G, Eijkel J C T, Manz A. Analyst , 2000 , 125(4):677 68324 Domansky, K.; Inman, W.; Serdy, J.; Dash, A.; Lim, M. H. M.; Grif

28、fith,L. G. Lab Chip 2011, 10 (1),515825 Sanders J C , Breadmore MC , Kwok YC , Horsman KM, Landers J P. Anal . Chem. , 2003 , 75 (4):986 99426 Fido, R. J.; Tatham, A. S.; Shewry, P. R. Methods Mol. Biol. 1995,49, 423437.27Pan, W.; Chen, W.; Jiang, X. Anal.Chem. 2010, 82, 3974397628Anderson, G. J.; C

29、, M. C.; Kennedy, R. T. Anal. Chem. 2011, 83, 13501355.29 Yang, S.; Liu, J.; DeVoe, D. L. Lab Chip 2008, 8, 1145115230 Chen, D.; Chen, S.; Wang, W.; Liu, F.; Zhang, C.; Zheng, H.Acta Otolaryngol. 2010, 130, 1411142031T. Braschler, N. Demierre, E. Nascimento, T. Silva, A. G. Oliva and P. Renaud, Lab

30、Chip, 2008, 8, 280286.32 S. M. Hagsater, A. Lenshof, P. Skafte-Pedersen, J. P. Kutter,T. Laurell and H. Bruus, Lab Chip, 2008, 8, 1178118433L. Johansson, F. Nikolajeff, S. Johansson and S. Thorslund, Anal. Chem., 2011, 8, 188192.34 J. Persson, P. Augustsson, T. Laurell and M. Ohlin, FEBS J.,2008, 27

31、5, 56575666.35 Z. G. Wu, B. Willing, J. Bjerketorp, J. K. Jansson and K. Hjort,Lab Chip, 2009, 9, 1193119936A. Russom, A. K. Gupta, S. Nagrath, D. Di Carlo, J. F. Edd and M. Toner, New J. Phys., 2010, 11, 07502537蔣維鈞(Jiang WJ ) , 顧惠君( Gu H J ) . 化工原理(Theory of Chemical Engineering) . 北京: 清華大學出版社(Bei

32、jing: Tsinghua University Press) , 1998. 13938 S. Choi and J. K. Park, Lab Chip, 2007, 7, 89089739 V. VanDelinder and A. Groisman, Anal. Chem., 2006, 78, 37653771.40 E. Sollier, H. Rostaing, P. Pouteau, Y. Fouillet and J. L. Achard,Sens.nature Bio, 2008, 141, 617624.41 A. Russom, A. K. Gupta, S. Nagrath, D. Di Carlo, J. F. Edd and M. Toner, New J