1、生物電子顯微技術生物電子顯微技術 第二章第二章透射電鏡的結構與成像原理透射電鏡的結構與成像原理生物電子顯微技術生物電子顯微技術第一節第一節 透射電鏡的結構透射電鏡的結構一、電子光學系統一、電子光學系統二、真空系統二、真空系統三、供電系統三、供電系統( (電子學系統電子學系統) )生物電子顯微技術生物電子顯微技術 電子光學系統 真空系統 供電系統三大部分TEMTEM的基本構造的基本構造生物電子顯微技術生物電子顯微技術 電鏡的組成(一）生物電子顯微技術生物電子顯微技術電鏡的組成（二）電鏡的組成（二）生物電子顯微技術生物電子顯微技術高壓電纜電子槍室第一、二聚光鏡 光闌樣品臂物鏡中間鏡投影鏡觀察窗熒光

2、板底片盒TEM剖面圖觀察室生物電子顯微技術生物電子顯微技術（一）、電子槍 1、電子槍結構 1) 自給偏壓式三極電子槍 陰極：尖端發射電子 柵極：控制電子束形狀和發射強度 陽極：加速電子、調節電子波長一、一、 電子光學系統電子光學系統生物電子顯微技術生物電子顯微技術 電子槍典型結構的主要部件圖生物電子顯微技術生物電子顯微技術電子束形成示意圖生物電子顯微技術生物電子顯微技術燈絲加熱溫度和發射電流之間的關系TI生物電子顯微技術生物電子顯微技術1、電子槍結構、電子槍結構2) 場發射電子槍陰極：鎢絲針尖陰極，其曲率半徑10002000。第一陽極：相對于陰極有一正壓，引發陰極場發射并控制發射電流強度。第二

3、陽極：加速電子、調節電子波長生物電子顯微技術生物電子顯微技術場發射式電子槍場發射式電子槍生物電子顯微技術生物電子顯微技術名詞名詞： 場發射場發射：在金屬表面加上極強的電場之后，金屬：在金屬表面加上極強的電場之后，金屬表面勢壘降低表面勢壘降低,在隧道效應的作用下，金屬內部的在隧道效應的作用下，金屬內部的自由電子穿過勢壘從金屬表面發射出來，向真空飛自由電子穿過勢壘從金屬表面發射出來，向真空飛去，這種物理現象稱為場發射去，這種物理現象稱為場發射 場發射電子槍特點場發射電子槍特點：亮度高；交叉光斑小，直徑1 m，最小30100；能量分散小；壽命長，給定壽命2000小時（實際可用3年左右）；分辨率高，高

4、分辨率的TEM和SEM都采用。生物電子顯微技術生物電子顯微技術 1). 鎢絲陰極：熱電子發射, 最小交叉斑直徑 1050m , 壽命2025h,最長約200h 2). LaB6陰極：低溫熱電子發射亮度高, 壽命約 1000h 2、電子槍從材料可以分為：生物電子顯微技術生物電子顯微技術1、磁透鏡的匯聚作用2、匯聚作用結論：磁透鏡總是匯聚透鏡磁場稍有變化，焦距f則有較大變化,磁場強度越強焦距越短透鏡的放大倍數越高。（焦度1/fHz2)，且電子加速電壓越高，電子速度越快，電子越不被易折射，焦距f就越長(二)、磁電子透鏡VNIKf2)(1生物電子顯微技術生物電子顯微技術Hr：磁場：磁場強度的徑向強度的

5、徑向分量分量Hz：軸：軸向分量向分量1-3rFzr生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術幾何光學作圖法幾何光學作圖法生物電子顯微技術生物電子顯微技術1). 聚光鏡聚光鏡 ：匯聚電子束，控制束斑的大小 控制孔徑角 第一級聚光鏡C1：短焦距強磁透鏡 第二級聚光鏡C2：長焦距弱磁透鏡 2). 物鏡物鏡 作用：形成樣品第一級放大的像; 改變其焦距f，對象進行精確聚焦.類型：短焦距強磁透鏡3、TEM的磁透鏡生物電子顯微技術生物電子顯微技術3).與物鏡相關的裝置與物鏡相關的裝置 A.物鏡極靴 保證磁場的軸對稱，防止磁飽和,減少磁場能量的浪費B.物鏡可動光闌 30，50，70 m

6、控制物鏡孔徑角、減小球差 、增強像的反差C.物鏡消像散器 消除像散，提高物鏡分辨率D.物鏡的散熱裝置 維持物鏡低恒溫，減少物鏡熱漂移30，50，70 m生物電子顯微技術生物電子顯微技術電子束極靴電磁線圈電磁線圈物鏡極靴縱面圖生物電子顯微技術生物電子顯微技術帶極靴的磁透鏡生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術4). 中間鏡和投影鏡中間鏡和投影鏡 中間鏡中間鏡 類型：長焦距弱透鏡類型：長焦距弱透鏡 倍率可變倍率可變 M20， 可設二級可設二級 作用：第二次放大圖象、控制總放大倍數作用：第二次放大圖象、控制總放大倍數 投影鏡投影鏡 類型：類型

7、： 短焦距強透鏡，可設二級短焦距強透鏡，可設二級 作用：第三次放大圖象作用：第三次放大圖象 生物電子顯微技術生物電子顯微技術總放大倍數：M總=MO MI MP其中： MO：物鏡放大倍數 MI ：中間鏡放大倍數 MP：投影鏡放大倍數 物 鏡：Objective Lens (OL) 中間鏡：Intermediate Lens (IL) 投影鏡：Projector Lens (PL)生物電子顯微技術生物電子顯微技術物鏡100X樣品第一級實像中間鏡20X第二級實像最終像投影鏡100X生物電子顯微技術生物電子顯微技術1）位置：聚光鏡和物鏡之間2）作用：更換樣品，承載樣品，移動樣品3）組成：樣品載體，樣品

8、架，樣品臺，樣品移動機構，空氣閉鎖裝置，防污染裝置4）結構分類： 頂落式頂落式：樣品臺在物鏡激勵線圈上方，樣品架由上而下落入物鏡中，穩定度高，可以獲得高分辨率圖像。 側插式側插式：樣品臺在物鏡激勵線圈下方，樣品架由上側面進入物鏡中，結構復雜可以獲得最短物鏡焦距，常采用（三）、樣品室（三）、樣品室生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術防污染裝置冷阱銅塊（-100-150C）樣品入射電子空心圓孔生物電子顯微技術生物電子顯微技術觀察裝置熒光板 （5070nm),散射反差為主散射反差為主小結構小結構:（t50nm),位相反差為主位相反差為主特小結構特小結構:（d1nm,t10

9、nm),唯一的反差：唯一的反差： 位相反差位相反差生物電子顯微技術生物電子顯微技術4、提高反差的方法、提高反差的方法 操作電鏡操作電鏡縮小孔徑角降低加速電壓暗場觀察離焦反差 其中： （由盧瑟福散射定律推出） DN/N ：被光闌擋掉的電子的機率 Z ：原子序數 e：電子電量 ：孔徑角 V： 電子加速電壓 M：樣品原子量 N0：阿伏伽德羅常數生物電子顯微技術生物電子顯微技術 dN/N=C*t 即t dN/N 從比較大的t值與很小的t值間, t越大, 結論結論: dN/N越大,像的反差越強dN/N=10dN/N=5dN/N=1反差大反差小生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技

10、術 同理可得: 越小，C越大， t稍有變化，dN/N就有很大變化，即 dN/N越大、像的反差增大 V越小，像的反差增大 暗場觀察b,c暗場照明生物電子顯微技術生物電子顯微技術離焦反差 費涅耳環（條紋）： 當光照射到一個障礙物邊緣時，在該邊緣會產生一個次級波， 它與入射波發生干涉作用，在障礙物的邊緣處產生明暗相間 的干涉條紋。 生物電子顯微技術生物電子顯微技術 費涅耳環： 欠焦時 亮線 過焦時 暗線 正焦時 消失 故正焦時故正焦時 圖象的反差最小圖象的反差最小生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術 提高樣品本身的質量厚度差別提高樣品本身的質量厚度差別 電子染色 正染色，

11、負染色 超薄切片染色原則: 生物樣品不同區域不同組份對重金屬離子的結合力不同,t越大,結合重金屬離子越多; 金屬投影 增加厚度（f1時： AB面正焦，CD欠：CD正，AB欠 分類分類：殘余像散（用消像散器消除）， 二次像散（清洗） 消像散器消像散器的工作原理：在透鏡磁場中，用消散 儀產生一個弱的柱面磁場，并調節它，使之與要校正的像散大小相等、方向相反，從而抵消殘余像散。生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術畸變畸變：由于透鏡邊緣部分比中心部分的聚焦能力強， 致使物體上各點像的放大倍數，隨著物點離軸 的徑向距離的不同而變化 畸變程度： (

12、Rd)=CdR03 分類： 桶形畸變：Cd0,離軸越遠，物點放大倍數 旋轉畸變：由于球差的存在使電子束角度隨著 離軸距離而變化 扭曲畸變： （桶或枕）旋轉 注： 畸變只是像的比例失調，圖像是清楚的生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術 色差色差： （波長差） 定義定義：由于電鏡加速電壓波動導致電子束波長發 生變化，使得入射電子速度不一致，與速度 相應的電子波長也有一定的分散度，從而引 起的一種像差。 原理原理： V ， ， ， 電子越不易折射，焦距f大 V ， ， ，電子越易折射，焦距f小 同理： （光鏡） 紅光偏折最小，紅光焦長 紫光偏折最大，紫光焦短 分類分類：

13、中心色差，放大色差，旋轉色差， 放大旋轉色差生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術 形成色差的原因：形成色差的原因： f =Cc(V/V- 2I/I) 式中: f:焦差； Cc：色差系數 V/V：加速電壓相對起伏 I/I：透鏡激勵電流相對起伏 加速電壓的變化 透鏡激勵電流變化 電子與樣品的交互作用 減小色差的方法：減小色差的方法： 穩定加速電壓和透鏡激勵電流106min，減小光闌直徑（即孔徑角） 樣品做薄，提高加速電壓，使電子穿過樣品的速度變化小。 采用電子速度過濾器，減少參與成像電子速度分布生物電子顯微技術生物電子顯微技術C. TEM最佳分辨率最佳分辨率 電鏡的分辨

14、率主要取決于物鏡的分辨率 物鏡的分辨率取決于： 衍射差：d0.61/nsin=0.61 / 球差: sCs3 色差、像散：可以忽略 只考慮衍射差和球差的綜合效應 最佳1.1(/ Cs)1/4 opt=0.65(Cs 3) 最佳=0.2nm22 ds生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術 實際 (s2+ d2+ a2+ c2)1/2 一般TEM0.51nm（二）（二） 有效放大倍數：有效放大倍數： 植物細胞直徑100m 動物細胞1020 m 細菌的直徑1 m 病毒直徑10100nm 生物大分子110nm 小分子0.11nm 原子直徑0.1nm M有效 肉眼儀器生物電子顯

15、微技術生物電子顯微技術二二 透射電鏡的其它性能指標透射電鏡的其它性能指標1. 場深：也稱景深，指在保持像清晰度的條件下，物面允 許移動的距離。 Dfi=/ 特點：場深大, 可達1 m 容易聚焦，物面位置允許有Dfi長度的誤差 對于厚度小于場深的樣品，都能獲得高分辨率 圖像，尤其適合復型樣品；但同時也導致圖像 上下疊加背底昏暗2. 焦深：在保持像清晰度的條件下,像面許移動的距離 Dfo=M2* Dfi 特點：焦深大,M=500時，500m，最大可達10000m 照相時非常方便 生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術生物電子顯微技術三三 適用于透射電鏡的樣品適用于透射電鏡的樣品 1. 從

16、樣品類別上分： 超薄切片 冷凍蝕刻的復型膜 懸浮樣品的滴片 直接培養的單層細胞 2. 從研究內容上分 免疫電子顯微技術 電鏡放射自顯影技術 電鏡細胞化學技術 Xray微區分析生物電子顯微技術生物電子顯微技術 免疫電子顯微鏡技術的定義：免疫電子顯微鏡技術的定義：(Immune Electron Microscopy: IEM)又又叫免疫電鏡細胞化學技術，就是將免疫化學技叫免疫電鏡細胞化學技術，就是將免疫化學技術與電鏡技術有機地結合起來，研究抗原抗體術與電鏡技術有機地結合起來，研究抗原抗體相互作用的一種方法。抗原抗體之間的相互作相互作用的一種方法。抗原抗體之間的相互作用具有較高的特異性，相互作用后

17、，可直接形用具有較高的特異性，相互作用后，可直接形成或通過某種標記物形成大分子復合物或聚合成或通過某種標記物形成大分子復合物或聚合物。該生成物具有電子致密性，在電鏡下可以物。該生成物具有電子致密性，在電鏡下可以觀察到，又不影響免疫反應的特異性。那么，觀察到，又不影響免疫反應的特異性。那么，就可以在細胞超微結構水平上或分子水平上研就可以在細胞超微結構水平上或分子水平上研究免疫作用。這種在很高分辨本領電鏡下非常究免疫作用。這種在很高分辨本領電鏡下非常精確地顯示抗原所在位置的方法稱為精確地顯示抗原所在位置的方法稱為 生物電子顯微技術生物電子顯微技術免疫電子顯微鏡技術的免疫電子顯微鏡技術的原理：原理：

18、 用化學方法將不同大小的金粒與特異性抗體球蛋白在不影響特異性蛋白質免疫特性的前提下結合起來，制備成金標抗體(GA)。當GA與相應的抗原(直接法)或抗原抗體復合物(間接法)相遇時，即結合形成免疫金復合物，可用透射電鏡觀察反應結果：有金粒的地方，即為抗原或抗原抗復合物存在的地方。 不同抗原肽以不同種動物供體來的相應標記抗體順序反應，可在同一組織切片中標記兩種抗原肽。抗體以小金粒標記，另一抗體以大金粒標記，在透射電鏡下很容易將兩者區分開來。 兩種抗原肽分別與來自不同種動物供體的抗體發生反應，兔初抗用小粒金標記的豬抗兔IgG檢測；而豚鼠初抗IgG用大粒金標記的兔抗豚鼠IgG檢測。生物電子顯微技術生物電子顯微技術舉例：舉例：驗證植物的胞間連絲組分中，是否有actin（肌動蛋白）和 myosin（肌球蛋白）的存在。生物電子顯微技術生物電子顯微技術VAP (6-nm gold particles) and MP (18-nm gold particles)A coiled-coil interaction mediates cauliflower mosaic virus cell-to-cell A coiled-coil interaction mediates cauliflower mo