1、微管相關蛋白tau與Alzheimer病神經原纖維退變    Alzheimer病(AD)是成人癡呆癥中最常見的一種。神經細胞內的神經原纖維纏結(NFT)是其特征性腦損傷之一。NFT的主要組成成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白tau,這種tau蛋白以聚集的雙螺旋絲(PHF)存在。越來越多的實驗證明:NFT引起的神經原纖維退化在AD發病中起重要作用。本文將近年來對AD神經原纖維退化的分子機制以及抑制這種退變的可能性方面的研究作一綜述。 一、 AD神經元微管相關蛋白tau的異常修飾 正常tau蛋白是一種含磷蛋白質,每克分子tau蛋白中磷酸含量為23克分子。在

2、AD患者,tau蛋白被異常過度磷酸化,從而使每克分子tau蛋白的磷酸含量增高至59克分子1（注：1M=1mol/L）。AD腦中微管相關蛋白tau的含量顯著高于對照者,而升高的tau蛋白中以異常過度磷酸化的形式為主2。異常過度磷酸化促使tau聚集形成PHF。已發現PHF-tau至少在21個位點發生了異常磷酸化。有趣的是:PHF-tau中的這些異常磷酸化位點大部分都存在于大鼠及人類胎腦tau蛋白中3。據此有人推測:AD腦中tau蛋白異常磷酸化可能與大腦發育過程中控制tau磷酸化的途徑激活或在發育過程中特異性蛋白磷酸酯酶的失活有關。其確切機理有待更進一步的探討。除異常過度磷酸化外,AD腦中tau蛋白

3、還被異常糖化/糖基化4，5。糖基化和糖化分別代表兩種完全不同的生化過程4。 用不同生化分離技術可將AD-tau蛋白分成三個級分:(1)胞漿非異常修飾tau(C-tau)；(2)異常修飾易溶型tau(AD P-tau)；(3)異常修飾并聚集為PHF的tau蛋白(PHF-tau)1。根據PHF-tau在2%十二烷基硫酸鈉(SDS)中的溶解性質差異,又可將其分為PHF -tau和PHF -tau兩種。從病理學意義上,AD腦中tau蛋白的上述不同存在狀態可能反映了神經原纖維退化的不同發展階段,即正常tau(C-tau)首先被異常磷酸化成AD P-tau,然后再通過一個目前尚不完全了解的機制聚集成PHF

4、-tau。PHF -tau蛋白被部分泛素化修飾6，因為泛素是一種蛋白水解酶，PHF -tau的泛素化可能是機體試圖對其進行水解清除的一種代償反應。異常修飾的AD tau對Ca2+激活的中性蛋白水解酶抗性增加7。 二、 蛋白磷酸酯酶在tau蛋白異常磷酸化中的作用 AD腦中蛋白磷酸酯酶（PP）-2A,PP-2B, PP-1的活性均比年齡匹配的對照者低8。用PP-2A或PP-2B抑制劑處理培養神經母細胞瘤可導致tau蛋白的異常磷酸化9。在體外將AD P-tau分別與不同蛋白磷酸酯酶保溫再定量檢測其磷酸釋放量, 發現PP-2A,PP-2B和PP-1分別可使異常tau蛋白水解釋放其57%, 36%和30

5、%的磷酸基10。此外,酶動力學研究資料也證明:PP-2A是活性最強的AD P-tau磷酸酯酶,其去磷酸化作用的Km值為（8.0±2.8）mol/L8。PP-2A和PP-2B也可使PHF -tau蛋白不同位點去磷酸化，但此時需要的酶量遠高于使AD P-tau去磷酸化所需的酶量7。Yamamoto等11也發現:使PHF-tau去磷酸化所需的PP-2A,PP-2B和PP-1的量遠高于使胎腦tau去磷酸化所需的酶量，提示PHF/NFT結構的空間位阻效應可能不利于蛋白磷酸酯酶對其tau蛋白的去磷酸化作用。從上述研究資料可知：AD腦中蛋白磷酸酯酶的缺陷可能是導致tau蛋白異常磷酸化的主要原因。

6、PP-2A和PP-2B使AD異常磷酸化tau蛋白的去磷酸化活性可被Mn2+和Mg2+激活7，其中Mn2+的激活作用最強。此外,Ca2+/鈣調素也可增高PP-2B使異常tau蛋白的去磷酸化活性。這些實驗資料為AD預防治療新藥的開發提供了線索。 三、 去磷酸化對tau蛋白生物學活性的恢復 正常人腦tau蛋白的功能主要表現在兩個方面：(1)與管蛋白結合形成微管；(2)與已經形成的微管結合以維持其穩定性。AD異常修飾的tau蛋白喪失其上述生物學活性。PP -2A,PP-2B和PP-1使AD P-tau去磷酸化后可不同程度恢復其生物學功能。以微管形成的初速度及最后形成量為參數,Wang等發現PP-2A對

7、AD P-tau的生物學活性恢復能力比PP-2B和PP-1強9。此外,PP-2A和PP-2B的去磷酸化作用還可使PHF -tau不同程度恢復其生物學活性,同樣，PP-2A對PHF -tau的活性恢復作用遠強于PP-2B7。 單純去糖基化處理不能恢復異常tau蛋白的生物學活性。然而,去糖基化預處理可增加其后的去磷酸化作用對tau蛋白功能恢復的程度4。由此可見，tau蛋白的異常磷酸化不是異常糖基化，而是其功能缺陷的直接原因。而這種缺陷導致的生物學功能的改變在體外實驗中是可以被逆轉的。 四、 去磷酸化和/或去糖基化對PHF/NFT結構的影響 與正常細胞骨架組分不同,PHF是以右手螺旋盤繞形成的雙螺旋

8、絲結構:其螺旋絲的直徑約為2224 nm,每80 nm處有一狹窄區,其直徑約為10 nm。PHF 在電鏡下常見的是單個雙螺旋絲,而PHF 則常以纏結形式存在。將從AD腦中分離的PHF /NFT與PP-2A一起在體外保溫一定時間，并進行負染電子顯微鏡檢查,結果發現PP-2A可使PHF /NFT結構松解,這種松解作用隨體外保溫時間延長而變得漸趨明顯。進一步的定量分析結果表明:PP-2A處理的PHF/NFT樣品比對照組釋放顯著增多量的游離tau蛋白7。 內切糖苷酶F/N-糖苷酶F可選擇性使AD P-tau和PHF /NFT中的tau去糖基化4。經糖苷酶處理的樣品其螺旋結構消失,形成更加緊密,伸展束狀

9、的纖維絲結構,纖維絲的直徑約為(2.5±0.5)nm。單純去糖基化作用不能顯著增加tau蛋白從PHF/NFT結構中的釋放,然而,去糖基化后再用PP-2A處理可使PHF/NFT釋放的游離tau蛋白量比單純用PP-2A去磷酸化所釋放的tau量顯著增高4，7。提示:tau蛋白的異常磷酸化在PHF/NFT的形成及穩定性維持中均起作用, 而糖基化作用則主要與其結構的穩定性,尤其是PHF結構中螺旋的周期性維持有關。 有趣的是: 在體外將正常重組tau蛋白與AD P-tau一起保溫,所形成的產物在電鏡下呈直徑為2.13.3 nm的線性纖維12， 這種纖維結構與PHF去糖基化后所形成的結構非常相似4

10、。AD P-tau分子中既有異常磷酸化又有異常糖基化, 如果PHF中螺旋的周期性單純由聚糖分子維持, 則正常tau與AD P-tau的反應產物應該是PHF。據此推測, PHF的形成可能還需要更多現在尚不明了的因素參與。tau蛋白異常磷酸化與異常糖基化的相關關系至今尚未明了。 五、 蛋白激酶在tau蛋白異常磷酸化中的作用 根據蛋白激酶催化磷酸化反應序列的特點,可將絲氨酰/蘇氨酰蛋白激酶分為兩大類型:(1)脯氨酸指導的蛋白激酶(PDPK),該酶催化底物磷酸化反應的序列特點是-X(S/T)P-(X-任一氨基酸，S-絲氨酸,T-蘇氨酸,P-脯氨酸); (2)非脯氨酸指導的蛋白激酶（non-PDPK)。

11、在已知的21個PHF-tau蛋白異常磷酸化位點中,約有半數為PDPK位點,另一半為non-PDPK位點。由此可見,可能有一個以上蛋白激酶參與了AD tau蛋白的異常磷酸化過程,但是,這些蛋白激酶的性質尚不十分清楚。由于上述激酶單獨使用時對tau蛋白異常位點的磷酸化作用非常緩慢,提示tau蛋白并非是這些激酶的理想底物。 ManderKow小組報道:重組tau蛋白的ser-262位的體外磷酸化可完全抑制其與微管結合的功能13。Singh等發現:ser-262位的磷酸化只抑制約40%的tau蛋白生物學活性14，提示tau蛋白的生物學活性的表達與多個部位的磷酸化有關,而ser-262只是其中的一個。AD腦中GSK-3的表達量比對照者增高約50%,但沒有檢測到其