1、人細(xì)胞角蛋白17(CK-17酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供體外研究使用預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中CK-17含量。實驗原理用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗CK-17抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗CK-17抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CK-17呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值,計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板:一塊(96孔2.標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品:2瓶,每瓶臨用前以

2、樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為20ng/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋20ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml, 1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0ng/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制10ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml(不要少于0.5ml20ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。3.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。4.檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。5.檢測稀釋液B:1&#

3、215;10ml/瓶。6.檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100ul/孔,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A 的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。7.檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8.底物溶液:1×10ml/瓶。9.濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。10.終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4。標(biāo)本的采

4、集及保存1.血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請1000x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注:以上標(biāo)本置4保存應(yīng)小于1周,-20或-80均應(yīng)密封保存,-20不應(yīng)超過1個月,-80不應(yīng)超過2個月;標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測

5、;高血脂的標(biāo)本不需進行特殊處理,可直接檢測。操作步驟實驗開始前,請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時,均應(yīng)用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預(yù)實驗以建立最佳稀釋倍數(shù)。1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加

6、檢測溶液A工作液100ul(在使用前一小時內(nèi)配制,37,60分鐘。3.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干。4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液100ul,37,60分鐘。5.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干。6.依序每孔加底物溶液90ul,37避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止。7.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng),此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液

7、的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值。在加終止液后立即進行檢測。注:1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔,該孔不加任何試劑,只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。2.嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫。使用后立即冷藏保存試劑。3.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作

8、,避免酶標(biāo)板長時間處于干燥狀態(tài)。4.消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。5.在儲存和溫育時避免強光直接照射。6.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2-8保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,請精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10ul,以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;檢測液A、B,以及底物溶液在使用前,應(yīng)置于37溫育30分鐘;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。7.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實

9、驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性本試劑盒可同時檢測重組或天然的人CK-17,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。計算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如curve expert1.3,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),

10、即為樣品的實際濃度。注意事項1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。2.一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。3.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最好做復(fù)孔。4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。6.底物請避光保存。檢測范圍:0.312ng/ml-20ng/ml最低檢測限:0.078ng/mL說明1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。2.小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本/標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時,第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且,洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。3.試劑盒保存:部分試劑保存于