1、Q/KM ZJ 2008液體洗滌劑殺菌試驗規程（內部使用）2008年月日內部執行質量管理中心實驗室引用標準1、 GB15979-2002一次性使用衛生用品衛生標準2、 QB/T2738-2005日化產品抗菌抑菌效果的評價方法3、 QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗滌劑4、 2002 年版消毒技術規范(中華人民共和國衛生部)5、 2001 年版藥品微生物學檢驗手冊（科技出版社）殺菌率試驗規程1、試驗菌、試驗溫度、作用時間、試液濃度試驗菌種：金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），大腸桿菌（ 8099 或 ATCC 25922），白色念珠菌。 試驗溫度： 20± 1。作用時間： 最短不

2、得小于30s。常規作用時間為2min、5min、10min、 20min。 試液濃度： 中和劑鑒定用試液濃度應為正式殺菌試驗最高濃度。菌懸液用量：正式 殺菌試驗 用菌懸液的濃度、取量應與中和劑鑒定中1 組、 2 組所用 菌懸液的濃度、 取量相同。2、 細菌繁殖體懸液、菌片的制備程序：2.1 菌懸液的制備取凍干菌種管，在無菌操作下，以毛細吸管加入適量營養肉湯，輕柔吸吹數次，使菌種融化分散。取含 5.0ml-10.0ml營養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置37培養 18h24h。用接種環取第1 代培養的菌懸液，劃線于營養瓊脂培養基平板上，于37培養18h24h。挑取上述第2 代培養物中典 型菌

3、落，接種于營養瓊脂斜面，于37培養 18h24h，即為第3 代培養物（放在4左右冰箱中保藏。 每隔 2-3 個月移種一次，繼續保藏。 ）。取第3 代 14 代的營養瓊脂培養基斜面新鮮培養物（經18h 24h 培養），用5.0ml吸管吸取 3.0ml-5.0ml稀釋液加入斜面試管內， 反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml 吸管將洗液移至另一無菌 試管中，在手掌上振敲80 次（力度適中，勿濺出） ，以使細菌懸液均勻?；驈男迈r菌種斜面沾取少量菌 苔，接種在適合試驗菌生長的培養基中，37培養 18h 24h（或適宜時間）。作為原菌液。（源于藥品 微生物學檢驗手冊211 頁）細菌繁殖體懸液應保存在4冰

4、箱備用。 盡量減少在室溫下放置時間，以減少細菌的自然死亡。應當 天使用不得過夜。44回收菌數為1×10 9×10cfu/ml用 PBS液配置GB15979-2002 一次性使用衛生用品衛生標準回收菌數為1× 108 5× 108cfu/ml 用 TSB營養肉湯配置 2002 消毒技術規范2.2 、菌片的制備程序：消毒技術規范取凍干菌種管，在無菌操作下，以毛細吸管加入適量營養肉湯，輕柔吸吹數次，使菌種融化分散。取含 5.0ml-10.0ml營養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置37培養 18h24h。用接種環取第1 代培養的菌懸液，劃線于營養瓊脂培養基平

5、板上，于37培養18h24h。挑取上述第2 代培養物中典 型菌落，接種于營養瓊脂斜面，于37培養 18h24h，即為第3 代培養物。取第3 代 14 代的營養瓊脂培養基斜面新鮮培養物（經18h 24h 培養），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0mlTSB營養肉湯 加入斜面試管內 ，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml 吸管將洗液移至另一無菌試管中，在手掌上振敲80 次，以使細菌懸液均勻，含菌量1×108 5× 108cfu/ml 。用無菌鑷子夾住已滅菌10mm*10mm濾紙一角，一面朝上，注入10ul菌懸液，放到無菌平板內，37 溫箱中干燥20min-30min ，（

6、或在室溫自然陰干后使用）制成菌片。每個菌片回收菌落，按活菌培養計數 所得結果，應為5× 105 5× 106 cfu/片。）細菌繁殖體懸液和菌片，用畢應隨時保存在4冰箱內。盡量減少在室溫下放置時間，以減少細菌的 自然死亡。（應當天使用不得過夜。 ）3、操作程序3.1 、懸液定量法殺菌試驗操作程序、 樣品用無菌標準硬水稀釋至同中和劑鑒定用試液濃度，或低于中和劑鑒定用試液濃度，制成（稀釋 液）試驗樣液。、 將試管按需要數量分別排列于試管架上，各組由左向右，排序、標記。44、 配制菌懸液，濃度為1× 10 9×10cfu/ml GB15979-2002一次性使

7、用衛生用品衛生標準或188×10 5×10 cfu/ml 2002 消毒技術規范、 取殺菌試驗用無菌大試管，先加入0.5ml 試驗用菌懸液，再加入0.5ml 有機干擾物質，混勻，置 20±1 5min ，用無菌吸管吸取步驟1 中的試驗樣液4.0ml 注入其中， 立即開啟計時器， 并迅速混勻 （在 手掌上振搖80 次）。- 見消毒技術規范 或吸取試驗用菌懸液0.1ml ，加入到含 5ml 樣液的試管中，立 即開啟計時器，并迅速混勻（在手掌上振搖80 次）。 - 見 QB/T 2738-2005、 作用 2min、5min、10min、20min，即刻用無菌吸管吸取0

8、.5ml 移入鑒定合格的4.5ml 中和劑溶液 中（中和劑的濃度與容量應與鑒定試驗結果規定的相同）充分混勻，中和作用10min 后，取樣液、 10 倍 系列稀釋液0.5ml （見 GB15979-2002）或分別吸取1.0 ml（- 見消毒技術規范 ）（見圖四），置于 2 個滅菌平皿，用涼至4045營養瓊脂培養基或沙氏瓊脂培養基（酵母菌）15ml 作傾注，轉動平皿， 使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平板，35± 2培養 48h（細菌）或（酵母菌）25± 2培養 72h， 作活菌菌落計數。、 同時用稀釋液代替樣液進行平行試驗，作為陽性對照管。、 陰性對照組：分別吸取試驗用相關溶液

9、和培養基進行培養，觀察有無污染。、 計數菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌落數在 15cfu 300cfu 的平板為準，每 個稀釋度 3 個平板生長菌落數全部合乎上述標準，則以該 3 個平板的菌落平均值作為結果；若有 2 個符 合合乎上述標準，則以該合格的 2 個平板菌落的平均值作為結果。、 試驗重復3 次，求其平均值。根據各組活菌濃度（cfu/ml ），計算殺菌率，見計算公式1?；蚋鶕?各組活菌濃度換算為對數值（N），計算殺滅對數值，見計算公式2。3.2載體法殺菌試驗操作程序、試驗樣品用無菌標準硬水（過濾除菌）稀釋至規定濃度，制成（稀釋液）試驗樣液。、吸取樣液5.0ml 放入滅

10、菌平皿，另吸取PBS 5.0ml 注入平皿中，作為陽性對照皿。每皿用無菌鑷子 夾住菌片一角放入試樣皿和陽性對照皿。、作用至設定時間后，即刻用無菌鑷子夾住菌片一角，投入含5.0ml 中和劑的試管中（中和劑的濃度 與容量應與鑒定試驗結果規定的相同）充分混勻計時。( 見圖三 )、中和 10min 后，取樣液或 10 倍系列稀釋液 1.0ml （見圖四），置于兩個滅菌平皿，接種涼至 40 45營養瓊脂培養基或沙氏瓊脂培養基（酵母菌） 15ml，轉動平皿 10-20 下，使其充分均勻，凝固 后，于 35± 2培養 48h（細菌）或 72h（酵母菌），作活菌菌落計數。、試驗重復3 次，求其平均值

11、。、陰性對照組：分別吸取試驗用相關溶液和培養基進行培養，觀察有無污染。A、 PBC液（ 0.03mol/L磷酸鹽緩沖液）、B、 無菌標準硬水1ml 置于滅菌平皿內、C、 空白平皿，傾注營養瓊脂培養基（細菌）或沙氏瓊脂培養基（酵母菌）15ml 培養。、計數菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌落數在 15cfu 300cfu 的平板為準，每 個稀釋度 3 個平板生長菌落數全部合乎上述標準，則以該 3 個平板的菌落平均值作為結果；若有 2 個符 合合乎上述標準，則以該合格的 2 個平板菌落的平均值作為結果。4、計算公式1、殺菌率 X1（ A B）/ A×100% 式中： X1殺

12、菌率（ %）；A- 對照樣品平均菌落數；B- 被試樣品平均菌落數。2、殺滅對數值（ KL）對照組平均活菌濃度的對數值（No）試驗組活菌濃度的對數值（Nx） 備注：計算殺滅對數值時，取小數點后兩位值，可以進行數字修約。如果消毒試驗組消毒處理后平均生產菌落數，小于等于1 時，即大于等于試驗前對照組平均活菌濃度的對數值。 5、評價標準殺菌率 90%，產品有殺菌作用。 懸液定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數值5.00 ，可判定為消毒合格。6、 操作要點：（消毒技術規范2002 版）1、對接觸消毒劑（殺菌劑）的樣本，在達到規定作用時間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑 溶液中（中和劑的濃度與容量應與鑒定試驗結果

13、規定的相同）；2、即刻混勻，并按規定時間吸取樣液進行隨后的培養檢測；3、在將樣本接種培養基以前的操作，應按規定時間內進行，以免微生物與中和劑或中和產物接觸過久。審核：編制：中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序引用標準：QB/T2738-2005日化產品抗菌抑菌效果的評價方法（試驗菌懸液在1× 104 9× 104cfu/ml ）4 9× 104GB 15979-2002一次性使用衛生用品衛生標準（試驗菌懸液在1× 107 5×107cfu/ml ）2002消毒技術規范（試驗菌懸液在1× 10一、定義和術語cfu/ml ）中和劑 在微生物殺滅

14、試驗中，試驗微生物與殺菌劑作用達到規定時間的終點時，用以中和殘留的殺菌劑，使其不在持續抑制和殺滅微生物的試劑。中和產物 中和劑加殺菌劑（樣品）=9：1，作用 10min 配置而成。 二、 中和劑鑒定試驗原理中和劑鑒定試驗原理試驗分組第 1 組殺菌劑 菌液培養第 2 組（殺菌劑 菌 液 ） 中和劑第 3 組中和劑 菌液培養第 4 組（殺菌劑 中 和劑） 菌液第 5 組陽性菌數對照第 6 組陰性對照。培養培養觀察殺菌劑對觀察殘留殺菌觀察中和劑是觀察中和產陽性對照組。陰性對照組。試驗菌有無殺劑被中和后，否抑菌。物，或未被完滅或抑制能力受到殺菌劑作全中和的殘留試驗目的用后的試驗菌殺菌劑對試驗是否能恢復

15、生菌的生長繁殖長。是否有影響。三、 中和劑鑒定試驗中易出現的問題及解決方法出現的問題解決方法1、組無菌生長或組平板上少于5 個菌落，其它組正常。降低消毒劑濃度或縮短作用時間。2菌落數較多且數量基本相同，其它組正常。提高消毒劑濃度或延長作用時間。3組中和劑菌落數明顯少于PBS組菌數降低中和劑濃度或改變中和劑成分。4組（中和產物）菌落數明顯少于PBS組菌數， 其它組正常。提高中和劑濃度或改變中和劑成分。5多次更換中和劑均不能得到滿意結果。選用載體法進行中和劑鑒定，殺菌試驗同時用載體法進行。四、 1 鑒定試驗操作程序中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序- 消毒技術規范試驗分組第 1 組第 2 組第 3 組

16、第 4 組第 5 組第 6 組取試驗樣品4.0ml 加入各對應組取 4.5ml 中和劑 加 入 對 應 組取 4.9ml 中和產物 b 加 入對應組取 4.5mlPBS（稀釋液）加 入對應組20± 1恒溫5min菌懸液1.0ml菌懸液1.0ml0.1ml 菌懸液 0.4ml 硬水 混勻0.1ml 菌懸液0.1ml 菌懸液 0.4ml 硬水 混勻振敲 80 次，混勻作用至試驗預定時間，取 0.5ml 加入下列對應組作用 10min，取 0.5ml 加入下列各對應組PBS4.5ml中和劑4.5ml中和劑4.5ml中和產物4.5mlPBS4.5ml振敲 80 次、混勻/作用 10min/取

17、適宜稀釋度懸液 1.0ml接種平 板（ 2 個 / 樣本）活菌培養計數活菌培養計數用中和劑10倍系列稀釋用中和產物10 倍系列稀 釋用稀釋液 10倍系列稀釋PBS中和劑各 1.0ml 接 種平板第 1 組不長第 2 組菌數第 3、4、5 組菌數相似，第 6 組無菌中和劑鑒定評價規定菌或明顯少于第 2 組大于 5 且明顯少于第 3、 4、 5 組誤差率 15%生長三組間平均菌數 =（ 第 3+4+5 組菌數）÷ 3； 誤差率 %=（三組平均菌數 - 各組菌落平均數）中和劑鑒定合格標準中對1、 2 組菌數要求。05X（ 1-10 ）(X5) Y( 10) 1.5 Y的絕對值之和 /3 &

18、#215;三組間平均菌數×100符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，中和劑與試驗樣品的中結論和產物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑。cfu/ml ）a 菌懸液濃度及制備：消毒技術規范用 PBS（試驗菌懸液在1× 107 5× 107備注b 中和產物的配置：先將試驗樣液1.0ml 與中和劑溶液9ml 混合，作用10min 后制成四、 2 鑒定試驗操作程序中和劑鑒定試驗操作程序- 載體法試驗分組用無菌鑷子取 菌片加入下列第 1 組吸取試驗 樣品 5.0ml第 2 組吸取試驗樣品5.0ml 于無菌平第 3 組吸取中和劑5.0ml 于無菌第 4

19、組吸取中和產 物 5.0ml 于第 5 組吸取 PBS 5.0ml 于無菌第 6 組對應組于無菌平皿內平皿內無菌平皿內平皿內皿內作用至預定時間， 立即用無菌鑷子取出菌片移入對應組混勻作用10min，立即用無菌鑷子取出菌片移入對應組試管振打 80 次PBS5.0ml中和劑5.0ml中和劑5.0ml中和產物5.0ml稀釋液5.0ml作用 10min作用 10min/取原液或稀釋用稀釋液用稀釋液 10 倍用中和劑 10用中和產物用稀釋液10稀釋液液 1.0ml 接種平板（ 2 個/ 樣10 倍系列稀釋系列稀釋倍系列稀釋10 倍系列稀釋倍系列稀釋中和劑各 1.0ml本）接種平板操作要點即刻混勻，并按規

20、定時間接種培養基中和劑鑒定評價第 1 組不第 2 組有且較第第 3、4、5 組菌數相似，且其誤差率15%第 6 組無評價規定長菌或明顯少于第 2組1 組為多，較第3、 4、 5 組為少 的菌數生長，并三組間平均菌數 =（第 3+4+5 組菌數）÷3；菌生長中和劑鑒定合 格標準中對1、 2 組菌數要求。符合下表要求。0 5X（1-10 ）(X 5) Y( 10)1.5 Y誤差率 %=（三組平均菌數 - 各組菌落平均 數）的絕對值之和 /3 ×三組間平均菌數× 100符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，中和劑與試驗樣品的中結論和產物對指示菌無毒害，鑒

21、定為該試驗樣品的中和劑。a 菌懸液濃度及制備：用 PBS將指示菌制成1× 104 9× 104 cfu/ml懸液。（ -GB15979）cfu/ml ）備注消毒技術規范用 PBS（試驗菌懸液在1× 107 5×107b 中和產物的配置：先將試驗樣液1.0ml 與中和劑溶液9ml 混合，作用10min 后制成四、 3 鑒定試驗操作程序中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序- GB/T 15979 試驗分組第 1 組第2 組第 3 組第 4 組第 5 組第 6 組取 0.10ml 菌懸取試驗樣品5.0ml加入各取 5.0ml 中和取 5.0ml 中取 5.0mlPB

22、S液, 分別加入各組對應組劑 加 入 對 應組和產物 b 加入對應組（稀釋液）加入對應組振敲 80 次，混勻作用至試驗預定時間，取 0.5ml 加入下列對應組作用 10min，取 0.5ml 加入下列各對應組PBS4.5ml中和劑4.5ml中和劑4.5ml中和產物4.5mlPBS4.5ml振敲 80 次、混勻/作用 10min/取適宜稀釋度懸液 1.0ml 接種平 板（ 2 個 / 樣本）活菌培養計數活菌培養計數用中和劑10倍系列稀釋用中和產物10 倍系列稀 釋用稀釋液 10倍系列稀釋PBS中和劑各 1.0ml 接 種平板第 1 組不長第 2 組菌數第 3、4、5 組菌數相似，第 6 組無菌中

23、和劑鑒定評價規定菌或明顯少于第 2 組大于 5 且明顯少于第 3、 4、 5 組誤差率 15%生長三組間平均菌數 =（ 第 3+4+5 組菌數）÷ 3； 誤差率 %=（三組平均菌數 - 各組菌落平均數）中和劑鑒定合格標準中對1、 2 組菌數要求。05X（ 1-10 ）(X5) Y( 10) 1.5 Y的絕對值之和 /3 ×三組間平均菌數×100符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，中和劑與試驗樣品的中結論和產物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑。a 菌懸液濃度及制備：用 PBS將指示菌制成1× 104 9× 104 cfu/ml懸液。（ -GB15979）備注b 中和產物的配置：先將試驗樣液1.0ml 與中和劑溶液9ml 混合，作用10min 后制成七、消毒劑的常用中和劑的配置1、用于氯型殺菌劑（有效氯0.1-0.5% ）：硫代硫酸鈉2、用于非氧化型殺菌劑：a：磷酸二氫鉀1.36g 、磷酸氫二鈉2.83g 、卵磷脂 10.0g 、甘氨酸 10.0g 、吐溫 -80 30.0g 、蒸餾水1000mlb：磷酸二氫鉀1.36g 、磷酸氫二鈉2.83g 、卵磷脂 3.0g 、吐溫 -80 20.0g、