1、關于自然選育和誘變育種第一頁，共65頁幻燈片 第四章 自然選育和誘變育種第二頁，共65頁幻燈片第三頁，共65頁幻燈片 第一節第一節 自然選育自然選育 自然選育：不經人工處理，利用微生物自然選育：不經人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程的自然突變進行菌種選育的過程 一、引起自然選育的因素一、引起自然選育的因素 1、低劑量的誘變效應、低劑量的誘變效應 2、互變異構效應、互變異構效應第四頁，共65頁幻燈片基因突變基因突變第五頁，共65頁幻燈片二、微生物突變的類型二、微生物突變的類型1、 形態突變型2、致死突變型3、抗性突變型4、營養缺陷型突變型 第六頁，共65頁幻燈片三、微生物突變的特點

2、三、微生物突變的特點1 1、 不對應性不對應性2 2、 自發性自發性3 3、 稀有性稀有性4 4、 獨立性獨立性5 5、 誘變性誘變性6 6、 穩定性穩定性7 7、 可逆性可逆性 第七頁，共65頁幻燈片第八頁，共65頁幻燈片 第二節、第二節、 誘變育種誘變育種 一一 概念：概念： 誘變育種是利用各種誘變劑處誘變育種是利用各種誘變劑處理微生物細胞，提高基因突變理微生物細胞，提高基因突變頻率，再通過適當的篩選方法頻率，再通過適當的篩選方法獲得高產優質菌種的育種方法。獲得高產優質菌種的育種方法。 第九頁，共65頁幻燈片二二 誘變育種的原理誘變育種的原理 基因突變基因突變:染色體畸變和染色體畸變和點突

3、變。點突變。染色體畸變：指的是染色體或染色體畸變：指的是染色體或DNA片段發生缺失、易位、逆片段發生缺失、易位、逆位、重復等。位、重復等。點突變：指的是點突變：指的是DNA中的堿基發中的堿基發生變化。生變化。 第十頁，共65頁幻燈片三、常用的誘變劑種類三、常用的誘變劑種類1 1、物理誘變劑：紫外線、快中子、物理誘變劑：紫外線、快中子 2 2、化學誘變劑：、化學誘變劑：5 5BUBU（5-5-溴尿嘧啶）溴尿嘧啶） 硫酸二乙酯，亞硝基胍硫酸二乙酯，亞硝基胍3 3、生物誘變劑：噬菌體、生物誘變劑：噬菌體第十一頁，共65頁幻燈片3、使用方法：單一誘變劑處理:復合誘變劑處理：第十二頁，共65頁幻燈片誘變

4、育種中還常常采取誘變劑復合處理，使它們產生協同效應。誘變育種中還常常采取誘變劑復合處理，使它們產生協同效應。 第十三頁，共65頁幻燈片 四四、常用誘變、常用誘變劑的具體使用方劑的具體使用方法：法： 1 1、紫外線：紫外線：第十四頁，共65頁幻燈片 A A、誘變處理前，先開紫外燈預熱、誘變處理前，先開紫外燈預熱2020分鐘，分鐘，使光波穩定。使光波穩定。 B B、將、將3 35ml5ml細胞懸浮液置于培養皿細胞懸浮液置于培養皿, ,于于誘變箱內的電磁攪拌器上，照射誘變箱內的電磁攪拌器上，照射3 35 5分分鐘，進行表面殺菌。鐘，進行表面殺菌。 C C、打開培養皿蓋，開啟電磁攪拌器，邊、打開培養皿

5、蓋，開啟電磁攪拌器，邊照射邊攪拌。照射邊攪拌。 D、處理一定時間后，在紅外燈下，吸取一定量菌液，經稀釋后，取0.2毫升涂平板 。第十五頁，共65頁幻燈片 2. 5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶： A、稱取、稱取5-溴尿嘧啶，加入無菌生理鹽水溴尿嘧啶，加入無菌生理鹽水微熱溶解，使濃度為微熱溶解，使濃度為2mg/ml。 B、將細胞培養至對數期并重懸于緩沖液、將細胞培養至對數期并重懸于緩沖液或生理鹽水中過夜。或生理鹽水中過夜。 C、將、將5-溴尿嘧啶加入培養基內，一般為溴尿嘧啶加入培養基內，一般為1020微克微克/ ml，倒平板。，倒平板。 D、涂布菌液，在生長中誘變，挑單菌落、涂布菌液，在生長中誘變，挑單菌落

6、進行測定。進行測定。第十六頁，共65頁幻燈片五、誘變育種的一般程序第十七頁，共65頁幻燈片出發菌株出發菌株 菌種純化菌種純化同步培養同步培養制備單孢子懸浮液制備單孢子懸浮液誘變劑處理誘變劑處理 平板分離平板分離挑選疑似突變菌落純培養挑選疑似突變菌落純培養突變體的初步篩選突變體的初步篩選 重復篩選重復篩選選出突變體選出突變體 第十八頁，共65頁幻燈片1、同步培養、同步培養 誘變處理前，菌懸液的誘變處理前，菌懸液的細胞應盡可能達到同細胞應盡可能達到同步生長狀態，培養出步生長狀態，培養出生理活性一致的細胞。生理活性一致的細胞。同步生長細胞的培養就及其收集 第十九頁，共65頁幻燈片第二十頁，共65頁幻

7、燈片2.孢子或菌體懸浮液的制備孢子或菌體懸浮液的制備 用生理鹽水或緩沖溶液配制，先用無菌的玻用生理鹽水或緩沖溶液配制，先用無菌的玻璃珠振蕩分開，再用脫脂棉過濾。璃珠振蕩分開，再用脫脂棉過濾。第二十一頁，共65頁幻燈片 3變異菌株的初步篩選變異菌株的初步篩選 1）利用形態突變直接淘汰低產變異菌株。）利用形態突變直接淘汰低產變異菌株。 2）利用平皿反應直接挑取高產變異菌株。）利用平皿反應直接挑取高產變異菌株。 第二十二頁，共65頁幻燈片飽浸含某種指示劑飽浸含某種指示劑的固體培養基的濾的固體培養基的濾紙片變色圈紙片變色圈 指示劑直接摻入或噴灑固體培養指示劑直接摻入或噴灑固體培養基，菌落周圍形成變色圈

8、。如淀基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液粉的平皿上噴上稀碘液 固體培養基中滲入溶解性差、固體培養基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養成分，可被特定菌利用的營養成分，造成不透明的培養基背景。菌造成不透明的培養基背景。菌落利用此物質形成透明圈。落利用此物質形成透明圈。利用一些有特別營養要求的利用一些有特別營養要求的微生物作為工具菌，如待篩微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養物的前體轉選菌具有該營養物的前體轉化成營養物化成營養物 能力，工具菌能力，工具菌就能圍繞該菌生長就能圍繞該菌生長 待篩選的菌株能分待篩選的菌株能分泌產生某些能抑制泌產生某些能抑制工具菌生長的物質工具菌生長的物質

9、 第二十三頁，共65頁幻燈片第三節第三節 營養缺陷型突變體的篩選及應營養缺陷型突變體的篩選及應用用 一、營養缺陷型：指通過誘變而產生的喪失一、營養缺陷型：指通過誘變而產生的喪失了合成某種營養物質了合成某種營養物質 的能力，必須在基本的能力，必須在基本培養基中加入相應缺陷的物質才能正常生培養基中加入相應缺陷的物質才能正常生長的變異菌株。長的變異菌株。第二十四頁，共65頁幻燈片 二、篩選營養缺陷型的培養基二、篩選營養缺陷型的培養基 ： 基本培養基基本培養基- :凡是能滿足某種野生菌株凡是能滿足某種野生菌株 營養要求最低成分的合成培養基。營養要求最低成分的合成培養基。 完全培養基完全培養基:凡能滿足

10、一切營養缺陷株營養凡能滿足一切營養缺陷株營養需要的培養基需要的培養基+ 。第二十五頁，共65頁幻燈片 補充培養基補充培養基A：只能滿足相應的營養缺：只能滿足相應的營養缺陷型生長需要的組合培養基。陷型生長需要的組合培養基。第二十六頁，共65頁幻燈片三、營養缺陷型菌株篩選的一般方法三、營養缺陷型菌株篩選的一般方法 1.誘變處理誘變處理2.淘汰野生型淘汰野生型第二十七頁，共65頁幻燈片 A、抗菌素法: 將抗生素加入到基本培養基中，殺死生長野生型菌株，濃縮營養缺陷型。第二十八頁，共65頁幻燈片第二十九頁，共65頁幻燈片B、菌絲過濾法、菌絲過濾法: 誘變后的孢子在誘變后的孢子在中培養一段時間后中培養一段

11、時間后過濾，去除過濾，去除大部分野生型菌株，濃縮營養缺陷型大部分野生型菌株，濃縮營養缺陷型 。Sartorius正壓式過濾器正壓式過濾器第三十頁，共65頁幻燈片三、檢出所需缺陷型三、檢出所需缺陷型 逐個檢出法逐個檢出法 經誘變處理后的細胞涂布在平板上，待長出單經誘變處理后的細胞涂布在平板上，待長出單個菌落后，用接種針將這些單個菌落逐個依次個菌落后，用接種針將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養基和另一完全培養基地分別接種到基本培養基和另一完全培養基 。經培養后，如果在完全培養基上的某一部位。經培養后，如果在完全培養基上的某一部位上出現菌落，而在基本培養基上卻不長菌上出現菌落，而在基本培養基

12、上卻不長菌 ，說明這是一個營養缺陷型。說明這是一個營養缺陷型。 第三十一頁，共65頁幻燈片三、檢出所需缺陷型三、檢出所需缺陷型 影印培養法影印培養法 將長出菌落的平皿開口朝下，在絲絨布上輕輕地印將長出菌落的平皿開口朝下，在絲絨布上輕輕地印一下，把此皿上的全部菌落轉印到另一基本培養基一下，把此皿上的全部菌落轉印到另一基本培養基平板上。經培養后，比較這兩個平皿上長出的菌落平板上。經培養后，比較這兩個平皿上長出的菌落，如果發現前一平皿上某一部位長有菌落，而在后，如果發現前一平皿上某一部位長有菌落，而在后一培養基的相應部位上卻沒有，說明這就是一個營一培養基的相應部位上卻沒有，說明這就是一個營養缺陷型。

13、養缺陷型。第三十二頁，共65頁幻燈片第三十三頁，共65頁幻燈片一般從菌落大小也可一般從菌落大小也可以判斷，新長出的菌以判斷，新長出的菌落較小，即是營養缺落較小，即是營養缺陷型陷型 夾層培養法 A A、夾層培養法、夾層培養法: :先在培養皿中倒一薄層不先在培養皿中倒一薄層不含菌的基本培養基，待冷凝后加上一層含菌的基本培養基，待冷凝后加上一層含誘變處理菌液的基本培養基，其上再含誘變處理菌液的基本培養基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養基。經培養澆一薄層不含菌的基本培養基。經培養后在培養皿底用筆對首次出現的菌落作后在培養皿底用筆對首次出現的菌落作記號，然后再在其上倒一薄層完全培養記號，然后再在其上倒一

14、薄層完全培養基。再經培養后所出現的新菌落，多數基。再經培養后所出現的新菌落，多數為營養缺陷型。為營養缺陷型。第三十四頁，共65頁幻燈片 四四.鑒定營養缺陷型鑒定營養缺陷型生長譜法生長譜法第三十五頁，共65頁幻燈片方法一：把純化好的缺陷型菌株與基本培養基倒混方法一：把純化好的缺陷型菌株與基本培養基倒混 合平板或涂布平板，再在平板上點接各種營養物質合平板或涂布平板，再在平板上點接各種營養物質（最好稀釋成一定濃度，用濾紙片法接入），適溫（最好稀釋成一定濃度，用濾紙片法接入），適溫培養，觀察生長圈。此法可以在一個平板上對一株培養，觀察生長圈。此法可以在一個平板上對一株菌進行多種營養因子進行測定菌進行多

15、種營養因子進行測定 方法二：在基本培養基中加入某種營養物質方法二：在基本培養基中加入某種營養物質，倒混合平板，再點接菌株，觀察生長圈。此，倒混合平板，再點接菌株，觀察生長圈。此法可同時對多個菌株進行測定法可同時對多個菌株進行測定第三十六頁，共65頁幻燈片第三十七頁，共65頁幻燈片五、 營養缺陷型突變株的應用 1.工業微生物育種中，用于積累代謝中間產物 2.作為雜交、重組育種的遺傳標記 3.用于微生物代謝途徑研究 4.在轉化、轉導、原生質體融合、質粒和轉座子研究中用作標記菌株第三十八頁，共65頁幻燈片營養缺陷型的應用實例營養缺陷型的應用實例 利用營養缺陷型突變株來生產氨基酸和核苷酸是典型的例子利

16、用營養缺陷型突變株來生產氨基酸和核苷酸是典型的例子 第三十九頁，共65頁幻燈片天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶(AK)(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協同反饋所抑制被賴氨酸及蘇氨酸協同反饋所抑制 通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型不能產生蘇氨酸。不能產生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養基中缺陷型菌株能夠正常生長，并在限量高絲氨酸的培養基中缺陷型菌株能夠正常生長，并且因為消除了反饋抑制且因為消除了反饋抑制 突變型能過量生產突變型能過量生產L-L-賴氨酸賴氨酸 第四十頁，共65頁幻燈片第四節第四節 溫度敏感突變株的篩選溫度敏感突變株的篩選 一、溫度敏感

17、突變株（一、溫度敏感突變株（temperature-sensitive mutant, TS突變體）：突變體）： 突變株在一定溫度范圍內（許可溫度）正突變株在一定溫度范圍內（許可溫度）正常生長，其表型和野生型沒有區別，但超常生長，其表型和野生型沒有區別，但超出這一溫度范圍（非許可溫度），則不能出這一溫度范圍（非許可溫度），則不能生長或生長微弱甚至死亡（條件致死）或生長或生長微弱甚至死亡（條件致死）或某些代謝停止或減弱。某些代謝停止或減弱。 第四十一頁，共65頁幻燈片二、二、TS突變的原理突變的原理 TSTS突變主要是由必需基因發生突變，致突變主要是由必需基因發生突變，致使該基因在一定溫度條件下

18、無法正常表使該基因在一定溫度條件下無法正常表達，或其編碼的酶失活，造成細胞不能達，或其編碼的酶失活，造成細胞不能正常生長。正常生長。第四十二頁，共65頁幻燈片三、三、 TS TS突變株的選育方法突變株的選育方法（一）（一） TS TS突變株的誘發突變株的誘發 TSTS突變主要由基因錯義突變所致，要選擇突變主要由基因錯義突變所致，要選擇易于引起堿基置換的亞硝基類、磺酸酯類易于引起堿基置換的亞硝基類、磺酸酯類化合物，或亞硝酸、化合物，或亞硝酸、UVUV等誘變劑。等誘變劑。（二）（二） 淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株/TS/TS菌株富集培養菌株富集培養 抗生素法：加入抗生素，在非許可溫度下抗生素法：加

19、入抗生素，在非許可溫度下培養一定時間，殺滅在該溫度下生長的野培養一定時間，殺滅在該溫度下生長的野生型菌株，再離心除去抗生素，分離生型菌株，再離心除去抗生素，分離 第四十三頁，共65頁幻燈片四、TS突變株分離篩選 富集培養后，用完全培養基先在許可溫度下培養富集培養后，用完全培養基先在許可溫度下培養，再用影印法、點植法等方法在許可溫度和非許可，再用影印法、點植法等方法在許可溫度和非許可溫度下分別培養，對照結果即可檢出溫度下分別培養，對照結果即可檢出 TSTS突變體；突變體； 也可同一平板先在非許可溫度培養，長出野生型也可同一平板先在非許可溫度培養，長出野生型菌株，做好記號，再轉許可溫度培養，則后長出的菌株，做好記號，再轉許可溫度培養，則后長出的為為TSTS菌株。菌株。第四十四頁，共65頁幻燈片五、五、 TS突變株在發酵工業中應用突變株在發酵工業中應用1 1、 在谷氨酸發酵中的應用在谷氨酸發酵中的應用 增加谷氨酸產量的關鍵在于改變菌體的細胞膜結構增加谷氨酸產量的關鍵在于改變菌體的細胞膜結構和功能，通過一些有效方法使谷氨酸產生菌由谷氨酸和功能，通過一些有效方法使谷氨酸產生菌由谷氨酸非積累型轉變為積累型。非積累型轉變為積累型。如：以乳糖發酵桿菌如：以乳糖發酵桿菌NO2256NO2256為出發菌株，選育出細胞膜為出發菌株，選育出細胞膜結構或功能缺損的結構或功能