1、RN碾取實驗操作步驟、注意事項及問題指南準備試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇，無RNase的水或0.5%SDS（溶液土需用DEPCM理過的水配制）。操作步驟：1 .勻漿處理a.植物組織：以葉片RNA提取為例.取新鮮葉片在液氮中充分研磨或將葉片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速，最好不要超過1min.,大約100mg葉片使用1mlTrizol.b.動物組織：以鼠肝臟RN破取為例.取新魚或-70C凍存組織，每50-100mg組織加1mlTrizol,用勻漿儀進行勻處理.樣品體積一般不要超過Trizol體積的10%.c.單層培養細胞.直接在培養板中加入Trizol裂解細胞，每10cm2面積加1

2、mlTrizol.用取樣器吹打幾次.注意：Trizol加量根據培養板面積決定，不是由細胞數決定.如果Trizol加量不足，可能導致提取的RNA中有DNA虧染.d.細胞懸液：離心取細胞，每5-10X106動物、植物和酵母細胞或每107細菌細胞加1mlTrizol。加Trizol前不要洗滌細胞，以免降解mRNA一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀處理。e.血液處理：直接取新鮮的血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置10min,10000rpm離心1min。棄上清，收集白細胞沉淀。每1ml血液收集的白細胞沉淀中加入1mlTrizol。2 .將勻漿樣品在15-30C放置5mim,使得核酸蛋白復合物

3、完全分離。3 .可選步驟：4C10000rpm離心10min,取上清。如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結節部分等，可離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA上清中含有RNA處理脂肪組織樣品時，上層是大量油脂，應除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。4 .每使用1mlTrizol加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s,室溫放置3min。如不能渦旋混勻，可手動顛倒混勻2min代替。5 .4C10000rpm離心10-15min,樣品會分成三層：紅色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNAi要在水相中，把水相（約600ul,約為所用Trizol試劑的60%）轉移

4、到新管中。（如要分離蛋白質和DNA可保留黃色的有機相）6 .在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇，混勻，-20C放置20-30min。植物或動物組織RN砒取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，導致電泳檢測時看不到RNA可以按以下步驟操作減輕污染：在上清中加入1/2體積的異丙醇，1/2體積的RNA©沉劑，然后進行以下操作。7 .4C10000rpm離心10min,去上清。離心前RNAM淀經常是看不見的，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。8 .加入1ml75%乙醇（DEPOK處理過的水配制）洗滌沉淀。每使用1mlTrizol至少加1ml乙醇。9 .410000rpm離心2min,棄上清；短暫

5、快速離心，用移液器小心吸棄上清，注意不要吸棄沉淀。10 .室溫放置晾干（不要晾得過干，RNA完全干燥后會很難溶解，大約晾干2-3min左右即可）。加入適量DEPCK（根據實驗需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS用槍頭吸打幾次，充分溶解RNA如RN刖于酶切反應，勿使用SD時液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解，-70C保存。注意事項：1 .從少量樣品中提取RNA（1-10mg組織或102-104細胞）：加800ulTrizol,樣品裂解后加氯仿，分層，沉淀RNA前，力口5-10ugRNase-free糖原，糖原會與RN2同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml時不會影響反轉錄cDN

6、AH一鏈的合成，也不影響PC或應。2 .勻漿后，加氯仿前，樣品可在-70C放置一個月以上：RNAM淀可以保存在75%酉精中，2-8C一個星期或-20C一年以上。如果要長期保存，RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中，-70C長期保存。預防RNase污染，應注意以下幾個方面：1 .經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。2 .使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。3 .RNA在Trizol試劑中不會被RNase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4h,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min,然后用水徹底清

7、洗，再滅菌，即可去除RNasa.配制溶液應使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至中濃度0.1%（v/v）,放置過夜，高壓滅菌。注：DEPCW致癌之嫌，需小心操作）。不同組織或細胞RNA提取預期得率植物葉片100-200ug/g葉片動物組織200-400ug/g肝臟組織動植物培養細胞5-10ug/106細胞大腸桿菌2-10ug/mlDH5“過夜菌血液3-5ug/ml人全血問題指南：低得率A.樣品裂解或勻漿處理不徹底B.最后得到的RNAM淀未完全溶解A260/A280<1.65A.檢測吸光度時，RNA羊品不是溶于TE,而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下A280會較（

8、Wj°B.樣品勻漿時加的試劑量太少。C.勻漿后樣品未在室溫放置5min。D.水相中混有有機相。E.最后得到的RNAM淀未完全溶解。RNA條解A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。B.樣品或提取的RNAM淀保存于-5-20C,未在-60-70C保存。C.細胞在胰蛋白酶處理時被破壞。D.溶液或離心管未經RNase去除處理。E.電泳時使用的甲酰胺pH低于3.5。DNA虧染A.樣品勻漿時加的試劑體積太少。B.樣品中含有組織溶劑（如乙醇，DMS降），強緩沖液或堿性溶液。蛋白和多糖污染A.樣品中蛋白、多糖含量高。B.樣品量太大。C.水相中混有有機相。D.第6步中加入RNA©沉劑可以幫助去除

9、這些污染。RNA取一般步驟總結RN碾取原理：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA再經過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA®無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。RN碾取的一般步驟所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑：提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性

10、條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。實驗步驟：破碎組織-分離RNA沉淀RNA洗滌RNARRNA保存RNA1、破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸月瓜、硫鼠酸月瓜、NP-40、SDS蛋白酶K等破碎組織，加入3-ME可以才制RNA®活性。2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。3、沉淀RNA-般用乙醇、3MNaAc(pH-5.2)或異丙醇。4、洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之

11、后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。5、融解RNA-般使用TE。6、保存RNAZ該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA,對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RN夠解在去離子的甲酰胺中，存于-70Co用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA勺雜物。來源于胰臟的RNA少可以在甲酰胺中

12、保存一年。當準備使用RNA寸，可以使用下列方法沉淀RNA加入NaAc至0.3M,12,000Xg離心5分鐘。氯化鋰法提取總RNA本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA丟失的缺陷。試驗試劑：1、氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,過濾滅菌】2、懸浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS試驗步驟：1、對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶液，勻

13、槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞（107個細胞/ml）,則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰一尿素溶液手工勻槳，并轉移至Eppendof管中。2、勻槳液在04C放置4小時后，12000g離心30分鐘。3、取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復步驟2。4、沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液復溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15-30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘。5、取上層水相，力口1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20c放置1小時，5000g離心。6、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA分裝，于70

14、c保存。蛋白酶-熱酚法-本方法適合于病毒RNA勺提取試驗試劑：1、蛋白酶K（終濃度50ug/ml）2、2X緩沖液：1%SDS20mMTris-HCL（pH7.6）?0.2MnaCL試驗步驟：1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37c40-50分鐘。2、加入等體積65c預熱的酚溶液，輕徭，在65c保溫5分鐘后再輕徭。3、離心，取上清，氯仿抽提一次。4、取上層水相，力口1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20c放置1小時，5000g離心（10000g,10min）。5、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA分裝，于70c保存。RNA取實驗經

15、驗心得總結一：實驗的準備實驗之前必須先準備好相關的試劑和實驗用品.試齊I：1.TRIZOL,一步法提取RNA用的，最好是INVITROGENE勺，100ml850RMB不過也有國產的，便宜些.這個試劑是非常關鍵的，也是不能省的，經常有很多朋友不想買這個，嫌貴，個人感覺是非買不可，不然用其他辦法自己配的話也不便宜，而且配的過程中很毒.2.異丙醇，無水乙醇，三氯甲烷（氯仿），DEPC3.逆轉錄酶等.一般如果做的次數不是很多的話可以買試劑盒的，里面什么都有，PROMEGA的也不是很貴，記得是30次的600多.但是如果實驗室做得比較多的話，還是自己分開買的比較好.MMLV逆轉錄酶個人覺得PROMEGA

16、的最好，而且不貴，其他公司我用得也不多，反正一直用PROMEGA,還有DNTP,oligod（T）n,RNA酶抑制劑，除了逆轉錄酶買PROMEGA的，其他的幾樣我都是買的TAKARA的，因為promega的其他幾樣都很貴，這樣配起來用一點也不比原裝的差.當然實驗室比較富裕的也可以買好的，不過話說回來，咱們花的經費大多數還是民脂民膏，這些不太關鍵的地方省著點比較好（我是不是太羅嗦了！）4.用具.各種大小的槍頭和EP管。由于RNA提取過程中對于RNA酶是非常敏感的，所以槍頭和管子都要做滅酶處理。滅酶的正常程序是用加入DEPC的水泡槍頭和管子，過夜。DEPC勺濃度是0.1%。DEP比強致癌物，做的時

17、候要戴手套口罩，作好防護措施。泡好后再高壓，烘干。滅酶除了用DEPC處理外，還可以用氯仿泡槍頭和管子，不用泡過夜，1-2小時就行，也沒有DEPOT么恐怖，泡后也是高壓烘干。5.水。實驗用的水也是很關鍵的，必須用DEPCb理滅過酶的水才可以。具體做法是將去離子水中加入0.1%DEPC搖過夜，之后再高壓。高壓這步是不能省的，因為必須用高壓把殘留的DEPO解掉，不然會影響后續的反應。二.實驗步驟TRIZOL提取RNA的原理就是利用變性劑將細胞裂解，釋放出蛋白質，DNARNA之后根據它們在不同PH值和不同極性溶劑中溶解度不一樣。而把RNA提取出來。詳細的原理可以自己查一查，在這里不做贅述。1.樣品處理

18、對于組織樣品，書上說白辦法是勻漿后加TRIZOL,但是我的經驗是用勻漿器勻漿的話很多組織都是沾在勻漿器的壁上了，所以我一般都是用小剪刀剪，剪的時候要耐心，剪得很碎才行。一般樣品其始量大概黃豆那么大一坨就行了，加ImlTRIZOL,然后在EP管中剪碎。樣品盡量用新鮮的，不是新鮮的泡在PBS中一段時間也行。樣品泡在TRIZOL里面后RNA就基本不會降解，這一步可以放在冰箱里面凍起來，可以保存一段時間2.RNA提取。往第一步中的剪碎的樣品和TRIZOL中加入0.2ml的氯仿，之后劇烈搖晃。震蕩，此時整個液體的顏色應該變成一種粉紅色的。之后靜置10分鐘，靜置后可以看到液體分層了。12000轉4度離心1

19、0分鐘，可以看見液體分層很明顯，最上面的是無色的水相，RNAt溶解在里面，中間一層是白色的固體，這層是蛋白質和DNA形成的復合體，下面是紅色的酚相。把上層水相吸到另外一個管子里面，注意不要把下面的兩層吸出來了，寧愿少一下沒關系。往水相液體中加入500ul的無水乙醇或者是異丙醇，上下顛倒混勻，此時如果RNAS多的話可以看見一些油一樣的東西，反正就是感覺怪怪的那種，不過一般都不會出現明顯的沉淀的。之后12000轉離心10分鐘，離心之后就可以看見管底有點半透明的東西了，那就是我們要RNA倒掉無水乙醇或者異丙醇，加入500ul用DEPCM理水配制的70%醇，以洗滌RNA加入后把管子敲一敲，盡量使RNA沉淀飄起來。之后在7500轉離心8分鐘，到掉乙醇，倒扣在干凈的吸水紙上面，空氣室溫干燥，時間可以稍長點，40分鐘到1小時，以看不見明顯的液滴為準。干后用20ul或者30ulDEPC水溶解RNA50度保溫1小時。之后