1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：學(xué)號：學(xué)院：專業(yè)、班級：實(shí)驗(yàn)課程指導(dǎo)教師及職稱開課學(xué)期 至學(xué)年上 學(xué)期云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)序號及名稱： 實(shí)驗(yàn)二、宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間：實(shí)驗(yàn)室：睿智三424一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海ㄒ唬┘?xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的個(gè)中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。（二） 、培養(yǎng)基的配制熟練掌握RPMI 1640培養(yǎng)基的配制方法（三） 、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1、 熟練掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作方法。2、觀察外培細(xì)胞在不同時(shí)期的形態(tài)變化及生長狀況。（四）、死活細(xì)胞的鑒別掌握死活細(xì)胞的鑒別原理及方法。二、儀器、材料

2、和試劑（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）1、儀器超凈工作臺、干燥箱、高壓鍋、過濾器2、材料紫外燈、微孔濾膜（直徑25mm）：孔徑為0.22um3、試劑75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH等（二）、培養(yǎng)基的配制1、 儀器超凈工作臺、微孔過濾器（0.22um）、高壓滅菌鍋、蒸餾水器、磁力攪拌器、天平、超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱2、 材料細(xì)胞培養(yǎng)瓶、微量加樣器、250ml和125ml試劑瓶、量筒、離心管、pH試紙、培養(yǎng)細(xì)胞3、 試劑HCl、 NaOH、 酚紅RPMI 1640干粉小牛血清、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺NaHCO3 、胰酶三蒸水（三）、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1、儀器超凈工作臺、微量加樣器（移液槍）

3、、倒置顯微鏡、高壓滅菌鍋、蒸餾水器、超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱2、材料細(xì)胞培養(yǎng)瓶、滴管、培養(yǎng)細(xì)胞（四） 、死活細(xì)胞的鑒別1、 材料：HeLa細(xì)胞株2、試劑：0.4%臺盼藍(lán)溶液（生理鹽水配制why？）三、實(shí)驗(yàn)原理、裝置示意圖：（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌操作的要求程度很高。細(xì)胞培養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。滅菌手段的選擇也十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。（二）

4、、培養(yǎng)基的配制組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長所必需的生長因子、激素、貼附因子等，是合成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。（三）、細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)：當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后（一般形成致密單層），則需要再做培養(yǎng)。即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，以適當(dāng)比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，此過程為傳代培養(yǎng)。一般將傳代

5、培養(yǎng)的積累次數(shù)作為傳代細(xì)胞的代數(shù)。貼壁細(xì)胞指的是體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支持物表面才能生長的細(xì)胞，貼壁后一般呈纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞兩種形態(tài)。貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層厚，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。對于貼壁不太緊的細(xì)胞如colo320，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細(xì)胞如HeLa、colo205貼壁細(xì)胞，則需要以細(xì)胞消化液消化后才能脫落和分散。常用的消化液為胰蛋白酶。胰酶消化的原理：胰酶是一種蛋白酶，通過特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞膜上和培養(yǎng)瓶壁結(jié)合處蛋白降解，致使兩者分離。這時(shí)細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨

6、架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。細(xì)胞消化用胰蛋白酶常用的工作液濃度為0.25%，PH為之間。胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過度會對細(xì)胞活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失，甚至造成細(xì)胞破碎；消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性。一般消化時(shí)間為1至3分鐘，肉眼觀察瓶壁由半透明轉(zhuǎn)為點(diǎn)狀透明時(shí)，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。（四）、死活細(xì)胞的鑒別細(xì)胞的存活率是反映細(xì)胞群體生活狀態(tài)的重要指標(biāo)。多種方法可以鑒別細(xì)胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：許多酸性物質(zhì)不容易穿過活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以

7、此來區(qū)別死活細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)方法、步驟、現(xiàn)象及注意事項(xiàng)：（一）細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗）1、清洗1）新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和有害物質(zhì)。2）使用過的玻璃器皿的清洗（1）立即進(jìn)入清水，避免干涸難洗；（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液過夜；（4）從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗3次，倒置烘干；（5）包裝（牛皮紙或不透水紙）；（6）高壓（15磅20min)或干熱（160度2h)滅菌；（7）備用。2、膠塞處理1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。2）自來水清洗10次3）

8、用1%稀鹽酸浸泡30min。4）自來水清洗10次，蒸餾水刷洗10次。晾干5）舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。3、塑料制品的清洗1）用洗滌劑清洗，自來水沖洗數(shù)遍2）強(qiáng)（次強(qiáng)）酸洗液浸泡26h.3）自來水沖洗10次以上，蒸餾水刷洗10次4）浸泡在70%乙醇0.51h,備用。5）用前從乙醇中取出，在超級工作臺內(nèi)紫外線照射1h。4、Tip和Tube的清洗1）新的國產(chǎn)Tip和Tube如用于非RNA提取時(shí)可用蒸餾水刷洗，晾干，高壓滅菌后使用。2）使用過的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L HCl溶液中，清水洗過，自來

9、水清洗10次晾干，進(jìn)洗液224h。晾干，放入飯盒高壓滅菌，備用。5、洗液的配制常用的洗液是硫酸-重鉻酸鉀溶液。洗液可根據(jù)需要配制不同的濃度（每4個(gè)同學(xué)配制120ml強(qiáng)洗液：重鉻酸鉀6.3g、濃硫酸100ml、蒸餾水20ml）成分強(qiáng)酸洗液強(qiáng)酸洗液重鉻酸鉀63g3150g120g60006濃硫酸1000ml50000ml200ml10000m蒸餾水200ml10000ml1000ml50000ml配制方法：1）將重鉻酸鉀放入大燒杯中，加入蒸餾水放在石棉網(wǎng)上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀充分溶解。2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸并用一長玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意：操作時(shí)注意安全，穿戴好

10、耐酸手套和圍裙，防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應(yīng)立即用大量清水沖洗。6、消毒和滅菌:1）射線消毒滅菌主要使用X、60Co進(jìn)行消毒滅菌，用于牛血清或塑料制品。2）紫外線消毒一般用無臭氧型紫外燈。一般20min，71%細(xì)菌消滅；40min后79%細(xì)菌消滅，60min后86%細(xì)菌消滅。紫外線照射時(shí)間照射再長也不能100%滅菌，最多只能達(dá)到90%。3）干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放入干燥箱內(nèi)，加熱至160度，保溫90120min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需要180度，保溫58h.4）濕熱滅菌也稱高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用布類、橡膠、金屬器械、玻璃

11、器皿、塑料以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機(jī)溶液。5）濾過滅菌用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液。7、化學(xué)消毒法1）70%（75%）酒精消毒2）0.1%新潔爾滅消毒3）來蘇兒水消毒4）0.5%過氧乙酸消毒5）乳酸蒸汽消毒6）37%甲醛加高錳酸鉀消毒7）煮沸消毒（二）、培養(yǎng)基的配制1、準(zhǔn)備(清洗與滅菌）2、合成培養(yǎng)基（RPMI 1640 ）的配制配制100ml RPMI 1640母液：1）每4小組合稱RPMI 1640干粉 1.04g，溶于100ml的3DW。2）置于攪拌器上攪拌40分鐘，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂?）通入CO2，使液體變?yōu)榻瘘S色，說明培養(yǎng)基完全溶好。4）溶好以后置于超凈臺中進(jìn)行0.22u

12、m濾過除菌，分裝至試劑瓶中。5）瓶口封好，-20或4貯存。3、小牛血清的處理1）新買的新生小牛血清一定要滅活；2）將新生小牛血清不開封置于56水浴鍋中30min,期間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。3）已滅活的血清貯存于4。4、生長培養(yǎng)基的配制1）雙抗：（100000u/ml）(1)160萬單位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20萬單位/ml(2)1g鏈霉素+5ml 3DW = 200000ug/ml(3)各取以上的液體5ml混合，使其濃度為10萬單位/ml，0.22um過濾至1.5ml離心管，-20貯存。2）谷氨酰胺儲備液（200mM）：(1)1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中

13、（30mg/ml=200mM),0.22um過濾至1.5ml離心管中。(2)-20貯存。注：200mM=200mmol/L（毫摩爾每升)3)飽和NaHCO3的配制(1)每組稱取10g的NaHCO3溶于200ml 3DW 中，過濾除菌后分裝于50ml試劑瓶。(2)4保存4) RPMI 1640生長培養(yǎng)基的配制50毫升儲備液濃度終濃度RPMI 1640培養(yǎng)液 44谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗雙抗100000u/ml100u/ml小牛血清510%NaHCO3調(diào)pH至7.0（三） 、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1、RPMI 1640生長培養(yǎng)基的配制50毫升儲備液濃度終濃度RPMI 1640培養(yǎng)液

14、44谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗雙抗100000u/ml100u/ml小牛血清510%NaHCO3調(diào)pH至7.02、傳代培養(yǎng)步驟（以下均為無菌操作）從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細(xì)胞并置于超凈工作臺，棄去培養(yǎng)液，加入0.6ml的0.25%胰酶溶液，以使細(xì)胞貼壁面充分浸潤，當(dāng)見到細(xì)胞貼壁面的瓶壁出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去胰酶溶液，并加入適量培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。細(xì)胞計(jì)數(shù)：取5ul細(xì)胞懸浮液加入等量臺盼藍(lán)染液，混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞的成活率。如果樣本成活率高，無污染即可用于傳代。 (計(jì)數(shù)結(jié)果：4.5×106個(gè)/ml)。將細(xì)胞分裝至新鮮的培養(yǎng)液中，使細(xì)胞的最終數(shù)量調(diào)節(jié)至1×1053×105個(gè)/mL。置于37二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。具體操作：每兩個(gè)小組共用一個(gè)培養(yǎng)瓶配制100ml的生長培養(yǎng)基每人取10ml培養(yǎng)基到自己的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)向細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)接種400ul的HeLa細(xì)胞株原液放入二氧化碳培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量看細(xì)胞瓶是否平放或直立放置（四） 、死活細(xì)胞的鑒別將細(xì)胞懸液充分混勻后取20ul放入干凈的離心管中，加入等體積的0.4