1、 學號: 4109014048 泰山醫(yī)學院畢業(yè)設(shè)計（論文）題目： 蜂膠黃酮抗H2O2誘導(dǎo)PC12細胞凋亡機制的研究院（部）系藥學院所 學 專 業(yè)藥學年級、班級完成人姓名指導(dǎo)教師姓名專業(yè)技術(shù)職稱 2013年 6 月 18 日論文原創(chuàng)性保證書我保證所提交的論文都是自己獨立完成，如有抄襲、剽竊、雷同等現(xiàn)象，愿承擔相應(yīng)后果，接受學校的處理。 專業(yè)： 班級： 簽名： 20 年 月 日摘 要目的 觀察蜂膠黃酮對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）凋亡的影響及機制。方法 培養(yǎng)PC12細胞，取對數(shù)生長期細胞分為五組，空白對照組、模型組、蜂膠黃酮高、中、低劑量組，劑量分別為200mg/L

2、、100 mg/L、50 mg/L.藥物預(yù)處理2h后，孵育H2O2（140mol/L）24h誘導(dǎo)過氧化損傷。TUNEL試劑盒檢測原位細胞凋亡,流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平以及細胞周期，ELISA檢測細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量。結(jié)果 TUNEL細胞凋亡染色顯示, H2O2組與空白對照組比較染色明顯加深,而蜂膠黃酮組染色明顯變淺，說明蜂膠黃酮能對抗H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡；周期結(jié)果顯示H2O2組處于G0/G1細胞明顯增多，而處于G2/M、S期細胞明顯減少，細胞增殖降低，而蜂膠黃酮增加S期細胞促進細胞增殖；與空白對照組相比H2O2組活性氧水平、細胞內(nèi)Caspase-3含量明顯增高，而蜂膠黃酮各劑

3、量組活性氧水平降低，Caspase-3含量減少。結(jié)論 蜂膠黃酮對H2O2誘發(fā)PC12神經(jīng)細胞凋亡有顯著的抑制作用，其機制可能其影響細胞周期、清除氧自由基、降低凋亡因子Caspase-3有關(guān)。 關(guān)鍵詞 蜂膠黃酮；PC12細胞；H2O2;Caspase-3；細胞凋亡AbstractObjective:To observe the protection ofpropolis flavonoidson rat with injuried pheochromocytomacells(PC12) induced byhydrogen peroxide(H2O2)and to explore its pos

4、sible mechanism.Methods:CulturePC12 cells,the cells inthe logarithmic growth phase weredivided into five groups,blank control group,model group,propolis flavoneof high,medium and low dose group,the dose of 200mg/L,100 mg/L,50 mg/L.After 2h 0fPharmacological preconditioning,the cellswere incubated wi

5、th H2O2(140 mol/L)for24hto induceoxidative damage.TUNEL Kitis used fordetermining Cell apoptosis,Flow cytometry was used to detect the intracellular ROS level and cell cycle,ELISA is used for determining the concentration of protein Caspase-3 in cells.Results:Apoptosis of TUNEL cells staining, H2O2

6、group compared with the control group, staining was deepened, and the propolis flavone group was significantly lighter, that propolis flavonoids can antagonize the apoptosis induced by H2O2 Cycle showed that H2O2 group in G0/G1 cells were increased, and in the G2/M,S phase cells decreased significan

7、tly, reduced cell proliferation, and propolis flavonoids increased S phase cells promoting cell proliferation; compared with the blank control group, caspase-3 in H2O2group, the levels of reactive oxygen species in cells increased significantly, while the propolis flavone in all dose groups decrease

8、 the levels of reactive oxygen species, reduced caspase-3 content.Conclusion: Propolis flavonoids on H2O2-induced PC12 cells damage a significant protective effect,The mechanism may be its effect on cell cycle, scavenging oxygen free radicals, decrease the apoptosis related factor caspase-3.Key word

9、s: Propolis; flavonoids; PC12 cells; H2O2; apoptosis目 錄正文011前言012儀器與試劑013實驗方法02 3.1 蜂膠總黃酮的提取與含量測定02 3.2 PC12細胞的培養(yǎng)及分組給藥02 3.3 TUNEL細胞凋亡原位檢測023.4流式細胞儀檢測細胞周期02 3.5流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平03 3.6 ELISA試劑盒檢測細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量034實驗結(jié)果03 4.1 TUNEL細胞凋亡原位檢測03 4.2流式細胞儀檢測細胞周期044.3流式細胞儀檢測細胞活性氧水平054.4 ELISA檢測細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量

10、065討論076結(jié)論08參考文獻09文獻綜述10致謝15蜂膠黃酮抗H2O2誘導(dǎo)PC12細胞凋亡機制的研究 學生：* 指導(dǎo)教師：* （泰山醫(yī)學院藥學院，泰安 271016）1 前言老年性癡呆 (Alzheimers disease, AD) 是一種以進行性認知功能障礙和記憶能力受損為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病嚴重威脅中老年人的健康，對社會和經(jīng)濟造成巨大壓力。因此，研究AD發(fā)病機制及尋求有效藥物防治已成為目前世界醫(yī)藥界的熱點和難點。氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)元在神經(jīng)退行性病變中具有重要的病因?qū)W意義。研究表明老年性癡呆與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。H2O2是和氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的活性氧之一，它參與了許多神經(jīng)

11、系統(tǒng)疾病的發(fā)病，與多種疾病如自身免疫病，腫瘤，炎癥以及細胞凋亡的發(fā)生有關(guān)，長期用作神經(jīng)細胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑。蜂膠(Propolis) 被譽為“紫色黃金”，是蜜蜂從植物新生枝嫩芽或花蕾處采集的樹脂類物質(zhì)，摻入其舌腺及蠟腺分泌物，經(jīng)蜜蜂反復(fù)混合而成的膠狀物質(zhì)。蜂膠富含多種具有藥用價值的活性成分，其中主要是黃酮類化合物。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蜂膠醇提物對東莨菪堿、亞硝酸鈉、三氯化鋁誘導(dǎo)的小鼠學習記憶障礙模型具有明顯保護作用，對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠學習記憶功能也有保護作用，其作用機制可能與其對抗小鼠體內(nèi)過氧化反應(yīng)有關(guān)1-2。通過MTT、流式細胞術(shù)等前期研究也發(fā)現(xiàn)蜂膠黃酮能有效的保護H2O2誘導(dǎo)的P

12、C12細胞損傷，提高細胞存活率，抑制細胞凋亡，為進一步研究其抗癡呆作用奠定了基礎(chǔ)。PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，在細胞形態(tài)，結(jié)構(gòu)，功能上與多巴胺神經(jīng)元有許多相似特征，能夠表達多巴胺轉(zhuǎn)運體，是體外神經(jīng)細胞損傷及保護作用研究使用最為廣泛的細胞系。本實驗擬培養(yǎng)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞株，以H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細胞損傷，蜂膠黃酮干預(yù)， TUNEL 染色觀察蜂膠黃酮的抗凋亡作用，并通過檢測細胞周期、活性氧及Caspase-3對蜂膠黃酮的抗凋亡機制進行研究。2 儀器與試劑2.1 材料和試劑蜂膠原膠，購自山東省實驗種蜂場；PC12 細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株），購自南京凱基生物技

13、術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,購自于索萊寶；完全DMEM 培養(yǎng)基、新生牛血清(NBS)，購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司；TUNEL細胞原位凋亡測定試劑盒、活性氧試劑盒及細胞周期檢測試劑盒（購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司）、ELISA試劑盒（藍基生物技術(shù)有限公司）。其它試劑均為分析純。2.2 儀器二氧化碳孵箱（Thermo）；單人雙面超凈工作臺（SW-CJ）；倒置式生物顯微鏡（XDS-1B）；酶標儀（Infinite f200）；流式細胞儀（FACSCalibur）；高速離心機（TGL-16G）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-600DB）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A 上海亞榮生化

14、儀器廠）、恒溫干燥箱（施都寶Bao-80A）、恒溫水浴鍋(HW.SY21-K)、超低溫冰箱（Thermo）。3.實驗方法3.1蜂膠黃酮的提取與含量測定取蜂膠50g粉碎，用85%乙醇浸泡4天，配料比蜂膠（g）：85%乙醇（ml）為1:30，在30條件下超聲50min后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)成浸膏狀，冰箱4內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴J丁為標準品，得標準曲線y=13.656x+0.0404， R2=0.9969，計算蜂膠中黃酮含量為：4.86mg/g。 3.2 PC12細胞的培養(yǎng)及分組給藥在37，恒濕的5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)PC12細胞，完全培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基中含10%新生小牛血清，加入100 g/ml鏈

15、霉素和100 g/ml氨芐青霉素。細胞為上皮樣貼壁生長，每23 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為五組：空白對照組、模型組、蜂膠黃酮高、中、低劑量組。加藥前先將蜂膠黃酮溶于DMSO中，再用完全培養(yǎng)基稀釋，使藥物終濃度為200 mg/L、100 mg/L、50mg/L，DMSO終體積為1，空白對照組及模型組加入含1DMSO完全培養(yǎng)基。藥物預(yù)處理2h后，再加入H2O2培養(yǎng)24h，24h后檢測各項指標。3.3 TUNEL細胞凋亡原位試劑盒檢測細胞以2105個/孔接種量接種于24孔帶爬片的培養(yǎng)板上，藥物分組處理后，取出爬片，自然曬干后用4%多聚甲醛室溫固定20-30min，PBS漂洗三次

16、，每次5min，1%TritionX-100通透5min，PBS漂洗，3% H2O2封閉10min，PBS漂洗吸干，每個樣本滴加50lTdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片放入溫盒，37避光反應(yīng)60min，PBS漂洗吸干，加5olStreptavidin-hrp工作液，加蓋玻片放入溫盒，37避光反應(yīng)30min，PBS漂洗吸干，加50lDAB工作液，反應(yīng)5min，顯微鏡下觀察，拍照。3.4 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞以1106個/孔的接種量接種于6孔培養(yǎng)板上。藥物分組處理后，加入不含EDTA的胰酶消化，加培養(yǎng)基終止消化，PBS沖洗2次，加入2ml-20預(yù)處理12h的70%乙醇固定24小時后，離心5min（小

17、于1000r/min），棄去乙醇，每管加入PBS洗兩遍，將細胞混懸后離心5min（小于1000r/min），按照1:50的RNaseA和PBS，37恒溫水浴鍋水解30min，過20目細胞篩于流式管內(nèi)，加入5l PI染色10-15min，流式細胞儀測細胞周期。通常用細胞增殖指數(shù)PI( pro liferation index)作為衡量細胞增殖的指標，PI即指處于DNA 合成期及有絲分裂期的細胞在全部細胞中所占比例，公式表示為: PI= ( S+ G2 /M ) / ( G0 /G1 + S+G2 /M) *100%3.5 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧細胞以1106個/孔接種量接種于6孔培養(yǎng)板上，藥

18、物分組處理后，加入不含EDTA的胰酶消化，加培養(yǎng)基終止消化，提取細胞，PBS離心沖洗2次，收集于流式管中，離心5min（1000r/min），按照1:1000有用無血清的培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，去PBS加入稀釋好的DCFH-DA，37孵育20min，3-5min搖勻一次使充分安裝探針，PBS洗三次，流式儀測細胞內(nèi)氧自由基含量。3.6 Elisa檢測Caspase-3 細胞以1106/孔的接種量接種于6孔培養(yǎng)板上。藥物分組處理后，加入不含EDTA的胰酶消化，加培養(yǎng)基終止消化，提取細胞,PBS洗三次，加微量PBS反復(fù)凍融三次，每次半小時，使細胞離解，細胞液檢測Caspase-3含量，取試劑盒至于

19、室溫平衡30min，再取酶標板按照標準品的次序加50l于空白孔，空白孔加50l樣品，空白50lPBS，在每個空加100l酶標記溶液（不含空白孔），封口37培養(yǎng)箱孵育1h（時間可適當延長），反復(fù)充分洗5次，拍干，各加50lA.B顯色劑，避光37孵育15min，加50l終止液，450nm檢測OD值。4 實驗結(jié)果4.1 蜂膠黃酮對細胞凋亡的影響蜂膠黃酮作用2h后加入終濃度為140mol/L H2O2作用24h后做TUNEL原位細胞凋亡染色，結(jié)果圖1所示，蜂膠黃酮組顏色明顯低于H2O2損傷組，說明蜂膠黃酮的凋亡率比模型組明顯降低。 圖1 TUNEL染色觀察蜂膠黃酮對H2O2損傷保護作用 (A空白對照組

20、200 B H2O2損傷組100 C蜂膠黃酮保護組100) 4.2 流式細胞儀法檢測細胞周期與空白組比較，給予H2O2后，G0/G1期細胞明顯增多，G2/M、S期細胞明顯減少（P0.01),細胞增殖降低，而蜂膠黃酮組G0/G1期細胞明顯減少，G2/M、S期細胞明顯增多，說明蜂膠黃酮具有促進細胞增殖（P0.05)。其中蜂膠黃酮組S期細胞增加較多，說明蜂膠黃酮可能會促進細胞有絲分裂。結(jié)果見表1、圖2。表1蜂膠黃酮對細胞周期的影響分組G0/G1G2/MS增殖指數(shù)（PI）空白對照組47.623.2*17.311.71*35.072.51*52.383.22*模型組（H2O2140mol/L） 63.3

21、42.510.750.9823.423.5534.173.81蜂膠高劑量組（ 200 mg/L）54.611.62*8.970.8434.481.54*45.391.61*蜂膠中劑量組（ 100 mg/L）57.851.23*9.921.1132.171.40*41.151.23*蜂膠低劑量組（ 50 mg/L）61.831.008.891.7929.291.0438.182.42 圖2蜂膠黃酮對細胞周期的影響（A空白組B模型組C蜂膠黃酮高劑量組D蜂膠黃酮中劑量組E蜂膠黃酮低劑量組） 4.3蜂膠黃酮對細胞內(nèi)活性氧水平的影響與空白組比較，給予H2O2后，細胞內(nèi)活性氧水平明顯提高（P0.05),而

22、蜂膠黃酮各劑量組能明顯降低細胞內(nèi)活性氧水平（P0.01)，且具有劑量依賴性，結(jié)果見表2、圖3。 表2 蜂膠黃酮對細胞內(nèi)活性氧水平的影響(xs, n=3) 組別活性氧( mg/ml )空白組76.361.83*模型組（ H2O2140mol/L）171.7924.01蜂膠黃酮高劑量組（ 200 mg/L）82.7514.73*蜂膠黃酮中劑量組（ 100 mg/L）103.2715.20*蜂膠黃酮低劑量組（ 50 mg/L ）151.9626.70* 注：與模型組比較*P0.05，*P0.01。圖3 蜂膠黃酮對細胞內(nèi)活性氧水平的影響（A空白組B模型組C蜂膠黃酮高劑量組D蜂膠黃酮中劑量組E蜂膠黃酮低

23、劑量組）4.4蜂膠黃酮對細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量的影響與空白組比較，給予H2O2后，細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量明顯提高（P0.05),而蜂膠黃酮各劑量組能明顯降低細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量（P0.01)，說明蜂膠黃酮可抑制凋亡因子的產(chǎn)生。結(jié)果見表3。 表3蜂膠黃酮對細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量的影響(xs, n=3)組別Caspase-3( ng/ml )空白組7.743.09*模型組（ H2O2140mol/L）34.631.19蜂膠黃酮高劑量組（ 200 mg/L）13.984.13*蜂膠黃酮中劑量組（ 100 mg/L）25.563.19*蜂膠黃酮低劑量組（ 50

24、 mg/L ）29.792.46* 注：與模型組比較*P0.05，*P0.01。5 討論PC12細胞在細胞生物學特征上和某些神經(jīng)元在發(fā)生上都源自神經(jīng)嵴細胞，因此在國內(nèi)外廣為用作研究神經(jīng)細胞的模型3。H2O2對細胞的損傷是通過在代謝過程中產(chǎn)生活性氧（ROS），ROS再引發(fā)一些氧化毒性產(chǎn)物的細胞毒作用損傷細胞4。本實驗通過H2O2損傷PC12細胞，蜂膠黃酮作用細胞，TUNEL細胞凋亡原位檢測染色，流式細胞儀檢測細胞活性氧水平和細胞周期，ELISA檢測細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量，結(jié)果顯示，TUNEL細胞凋亡原位檢測染色，蜂膠黃酮組顏色明顯低于模型組且接近空白組，說明蜂膠黃酮各劑量組明顯降低3-

25、OH斷裂誘導(dǎo)的細胞凋亡作用5、6。細胞周期檢測中，與空白組比較，給予H2O2后，G0/G1期細胞明顯增多，G2/M、S期細胞明顯減少,細胞增殖降低，而蜂膠黃酮組G0/G1期細胞明顯減少，G2/M、S期細胞增加,說明蜂膠黃酮具有促進細胞增殖的潛勢7。通過流式細胞儀檢測細胞活性氧水平，蜂膠黃酮組明顯低于模型組且接近空白組，說明有清除細胞內(nèi)氧自由基，抗氧化作用；ELISA檢測細胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量，蜂膠黃酮組明顯低于模型組且接近空白組，說明抑制細胞凋亡因子產(chǎn)生，減少細胞凋亡，并且隨蜂膠黃酮濃度增大效果更加明顯，所以還具有一定的劑量依賴性。以上實驗結(jié)果均顯示蜂膠黃酮對PC12具有明顯的抗凋亡

26、作用。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素標記dUTP在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3-OH末端，并可與連接辣根過氧化酶的鏈酶親和素特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺的存在下，產(chǎn)生很強的顏色反應(yīng)（深棕色），特異準確的定位正在凋亡的細胞，因而在普通顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞；由于正常的或者正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，沒有3-OH的形成，很少能夠被染色8。流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平，是一種利用熒光探針DCPH-DA進行的活性氧檢測的試劑盒，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，

27、進入細胞后，可以被細胞內(nèi)的酶水解生成DCFH，而DCFH不能通過細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)，細胞內(nèi)的活性氧使無熒光的DCFH生成有熒光的DCF,檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)的活性氧水平，實驗結(jié)果顯示，模型組細胞活性氧水平明顯高于正常組與蜂膠黃酮組，說明H2O2可使細胞過氧化，而蜂膠黃酮的三個劑量組細胞活性氧水平率稍高于正常組，明顯低于模型組，說明蜂膠黃酮對細胞有保護作用，可清除細胞內(nèi)氧自由基水平9。Caspase-3是調(diào)控凋亡最直接的基因，被稱為凋亡的執(zhí)行者，在許多凋亡過程中，Caspase-3被凋亡信號激活后由其前體形式轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓拿福閷?dǎo)下游的凋亡效應(yīng)，在正常細胞中以酶原形

28、式存在，氧自由基等刺激因子使線粒體通透性增加，線粒體跨膜電位下降，釋放細胞色素C，細胞色素C主要激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase-3，引起細胞形態(tài)的變化如出現(xiàn)皺縮、DNA裂解、染色體濃縮和凋亡，小體的形成，最終導(dǎo)致細胞凋亡10。本文結(jié)果表明，蜂膠黃酮在抗H2O2對PC12細胞的凋亡發(fā)揮抑制作用的機制可歸結(jié)為減少G0/G1細胞，增加 G2/M、S期細胞，而促進細胞增殖；抗氧化、清除氧自由基作用，與自由基直接結(jié)合，阻止Caspase-3蛋白活化。本研究結(jié)果表明蜂膠黃酮具有抗PC12神經(jīng)細胞凋亡作用，為蜂膠黃酮的臨床應(yīng)用和AD病的臨床治療提供了極有意義的藥理和藥物學依據(jù)11、12

29、。6 結(jié)論蜂膠黃酮對H2O2誘發(fā)PC12神經(jīng)細胞凋亡有顯著的抑制作用，其機制可能其影響細胞周期、清除氧自由基、降低凋亡因子Caspase-3有關(guān)。參考文獻1王浩,張慶樂,許利軍等.蜂膠醇提物對小鼠學習記憶的促進作用J.中國蜂業(yè)，2008,59(8):5-6,9.2 王浩,張慶樂,徐曉燕等.蜂膠總黃酮對衰老小鼠學習記憶影響的實驗研究J.中國老年學雜志，已接收.3ISH ISAWA R, UTSUMI K, UTSUM I T . Involvement of lysosomal cysteine proteasis in hydrogen peroxideinduced apoptosis in

30、 HL- 60 cells J. Biosci B iotechnol B iochem,2002, 66 ( 9 ) :1865-1872.4 徐穎.方金鳳，顧嵐，蜂膠黃酮清除自由基作用的研究_2008年 食品工業(yè) 第一期5 楊明,朱姝,隋殿軍等. 蜂膠總黃酮對大鼠心肌缺血 -再灌注損傷誘導(dǎo)細胞凋亡的影響J.中國藥理學通報,2005,21(5)551-554 6 宋明旭, 楊吉成, 王蔚平. 谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的研究. 蘇州科技學院學報. 2006,23(1): 62-65.7 費洪榮, 王李梅, 王鳳澤-泰山白首烏醇提物對HepG2肝癌細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用.8 謝大興_.細胞

31、周期檢測點的流式細胞術(shù)分析2009，31(1): 1-3 9 曹煒，尉亞輝 等.蜂膠對氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝臟損傷的保護作用J.中草藥, 10 聞春生，應(yīng)斌武，張永剛，槲皮素對肺腺癌細胞株A549細胞 caspase-3表達的影響 2000,15(1):67-71.11Shafer TJ, Atchison WD. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology.

32、 1991; 12(3): 473-492.12Biagas K. Hypoxicischemic brain injury: advancements in the understanding of mechanisms and potential avenues for therapy. Curr Opin Pediatr. 1999, 11(3): 223-228.轉(zhuǎn)貼于 中國論文下載中心et文獻綜述蜂膠主要成分及藥理作用摘要： 蜂膠中的活性物質(zhì)主要為類黃酮，研究證明其具有抗氧化、抗炎及保護心腦血管；提高免疫力的作用； 抑菌、抗病毒、抗炎作用從而促進傷口愈合和組織修復(fù)。此外蜂膠中的類黃酮

33、物質(zhì)還有預(yù)防腫瘤等藥理作用。關(guān)鍵詞：蜂膠；類黃酮；抗氧化；抗菌；抗病毒；增強免疫；抗腫瘤1 蜂膠的來源及其化學成分 蜂膠是工蜂從植物的新生支條、葉、芽或樹皮等組織上采集到樹脂狀分泌物后混入其上顎腺等腺體的分泌物和蜂蠟等加工而成的芳香性膠狀物，含有與膠原植物相類似的大量有效成分。蜂膠的化學成分很復(fù)雜，我國蜂膠成分主要含有三類，酚酸及醛類、黃酮類、酚酸酯類；含有大量的黃酮類、萜烯類化合物是蜂膠的重要特征，現(xiàn)已從蜂膠中分離鑒定的黃酮化合物有30余種，包括白楊素、柚柏楊素、芹菜素，金合歡素、槲皮素、高良姜素、蘆丁、山萘酸、山萘甲黃素、鼠李素、松屬素等，其5，7-二羥基-3，4-二甲黃酮和5-羥基4，7

34、-二甲氧基雙氫黃酮是蜂膠的特有成分，蜂膠大部分的生理及藥理功能都與此類化合物有密切關(guān)系。蜂膠所含有的豐富的黃酮類、萜烯類物質(zhì)是蜂膠的最大特點。它賦予蜂膠許多奇妙而獨特的生物學作用。蜂膠成分復(fù)雜、作用廣泛,讓科學家感到驚奇,人工無法合成類似的產(chǎn)品。 2 蜂膠的藥理作用 蜂膠具有抗氧化、抗炎、預(yù)防動脈粥樣硬化、降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)抑菌等多種生物學活性，體內(nèi)外實驗驗證蜂膠及其主要活性成分生物學活性作用的分子機制是近年來研究的熱點。2.1 抗氧化作用已知有許多常見的疾病，如癌癥、動脈硬化、糖尿病、白內(nèi)障、心血管病、老年癡呆、關(guān)節(jié)炎等，都被認為與自由基相關(guān)。蜂膠中含有大量的抗氧化活性成分，關(guān)于蜂膠抗

35、氧化的研究從未間斷過。蜂膠能抑制2,2-偶氮（2-脒基丙烷）二鹽酸鹽誘導(dǎo)的人紅細胞氧化溶血現(xiàn)象和脂質(zhì)過氧化，有效保護溶血紅細胞膜，使紅細胞中脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物丙二醛水平降低，且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性1。蜂膠能有效抑制低密度脂蛋白的脂質(zhì)過氧化和酪氨酸硝基化，減少內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達，抑制內(nèi)皮細胞還原型輔酶（NADPH）氧化酶的活性，說明蜂膠是通過增加血管內(nèi)皮細胞中一氧化氮的生物利用度而發(fā)揮潛在的心血管保護作用的2。2.2 抗炎作用蜂膠對血管內(nèi)皮細胞的影響具有劑量依賴性，低濃度的蜂膠能保護血管內(nèi)皮細胞，而高濃度蜂膠卻會誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡，具有細胞毒性。在去除血清和生長因子的條件下，高劑量的蜂

36、膠能破壞線粒體膜電位，是潛在的凋亡誘導(dǎo)劑，而低劑量的蜂膠能顯著降低膜整連蛋白4、PC-PLC、P53和ROS水平，保護血管內(nèi)皮細胞。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中，蜂膠能降低TLR4的表達和PCPLC的活性，進而抑制下游信號分子NF-Kb p65、p53、ROS和NO的水平，抑制LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷。在ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷條件下，蜂膠均能降PC-PLC的活性和ROS的水平，抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠水提取物對海綿植入小鼠的血管生成、炎癥細胞聚集和內(nèi)源性細胞因子能產(chǎn)生影響，表明蜂膠的抗炎癥和抗血管生成作用與細胞因子調(diào)控有關(guān)3。2.3 預(yù)

37、防動脈粥樣硬化蜂膠乙醇提取物可有效增加高密度脂蛋白膽固醇，減少動脈粥樣硬化的風險。將3H-膽固醇載貨巨噬細胞經(jīng)腹膜內(nèi)注入到灌服蜂膠乙醇提取物的小鼠體內(nèi)，可導(dǎo)致血漿、肝臟和糞便中的高密度脂蛋白膽固醇和腹膜巨噬細胞3H-膽固醇顯著增加，肝臟蛋白質(zhì)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1表達增加。細胞株HepG2和RAW264.7的體外實驗也證實了上述結(jié)果。這些研究表明，蜂膠乙醇提取物增強膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運可能是由于蜂膠乙醇提取物刺激血漿高密度脂蛋白水平和肝三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1表達所致4。2.4 降血糖作用利用鏈脲霉素構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型，鏈脲霉素+高

38、脂飼料構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，研究蜂膠改善糖尿病腎病可能的作用機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜂膠能有效改善1型糖尿病和2型糖尿病對大鼠造成的損傷。蜂膠均能抑制糖尿病大鼠體重下降，改善大鼠血液糖代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白代謝以及血液、肝、腎氧化應(yīng)激5。通過測定肝腎功能相關(guān)指標及組織切片觀察，結(jié)果表明蜂膠能改善糖尿病大鼠肝腎功能。蜂膠的效果發(fā)現(xiàn)，蜂膠對血糖的控制效果和肝臟的保護效果、改善氧化應(yīng)激的效果都很強。對維持糖尿病大鼠血糖穩(wěn)定和防止骨骼發(fā)生變化具有顯著作用。2.5抗腫瘤作用 蜂膠中含有豐富的抗癌物質(zhì)。研究證明，癌癥患者在服用蜂膠后，可縮小癌細胞且能減輕化療、放療引起的副作用。目前，蜂膠中抑制癌細胞的成分已被鑒定

39、出來，主要是caffeicacid類的衍生物，在1988年Grunberger等人便發(fā)現(xiàn)caffeicacidphenethylester（CAPE）對細胞具有選擇性的毒殺作用。CAPE可以抑制致癌基因的表現(xiàn)，可以誘導(dǎo)這些不正常細胞進行細胞凋亡作用（apoptosis），對正常的細胞則否6。對於受到致癌物質(zhì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)型的不正常細胞，CAPE同樣也可以使它們產(chǎn)生細胞凋亡作用。2.6 免疫調(diào)節(jié)活性蜂膠能明顯抑制同種異體CD4 T細胞的增殖，激活和抑制這些同種異體CD4 T細胞中IL-2、IFN-和IL-17的表達。蜂膠能選擇性地誘導(dǎo)增殖T細胞的凋亡，抗增殖作用是可逆的，也適用于活化的T細胞。蜂膠可用于

40、移植物抗宿主病的免疫抑制劑7。2.7抑菌作用蜂膠乙醇提取物對外陰陰道念珠菌具有抗真菌活性，為外陰陰道念珠菌病的治療和預(yù)防提供了重要信息8。蜂膠對Trichophyton violaseum、Triehophyton tonsorans和Epidermophyton flucosum 3種皮膚癬菌有很好的抗真菌作用。巴西綠蜂膠提取物能抑制頭癬和花斑癬，其作用效果堪比達克寧，可作為替代藥用于治療癬菌病。抑菌活性的研究拓展了蜂膠的應(yīng)用范圍。另外呂澤田等報道了蜂膠中黃酮類化合物抑制腫瘤作用的試驗與應(yīng)用，結(jié)果表明高劑量治療組小鼠瘤的抑制率為30；中劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率及各劑量吞噬指數(shù)顯著高于對照

41、組；高、中劑量組小鼠的脾臟（NK）自然殺傷細胞活性（%）亦顯著高于對照組。韓連堂等報道蜂膠對移植的小鼠S180肉瘤、肝癌具有明顯的抑制作用，其可能的抗癌機制包括：（1）抗氧化作用；（2）減少致癌物的合成、吸收和活化；（3）對細胞的分化、增殖、基因表達的影響；（4）對DNA損傷與修復(fù)的作用；（5）促進癌細胞凋亡；（6）對細胞的連接通訊的作用；（7）對機體免疫功能的作用。張建等對蜂膠提取物進行體外抗腫瘤實驗，結(jié)果表明：山東蜂膠乙醇提取物和乙醚提取物在體外對腫瘤細胞均具有較強的抑制作用。蜂膠乙醇提取物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的研究表明，腫瘤細胞經(jīng)蜂膠處理后，細胞形態(tài)呈現(xiàn)固縮，核染色質(zhì)固縮致密，DNA 電泳分

42、析顯示特征的梯度形圖譜；流式細胞儀檢測細胞周期，凋亡峰增高，且G0-G1與C2M期百分比增高，凋亡控制基因bel-2 基因表達的同時，激活了凋亡相關(guān)基因，啟動了細胞凋亡過程，表明蜂膠抗腫瘤作用是通過誘發(fā)細胞凋亡實現(xiàn)的9。韓連堂等應(yīng)用Ames試驗分別檢測蜂膠對環(huán)磷酰胺、疊氮鈉、正定霉素、2-氨基芴誘發(fā)突變的抑制作用，結(jié)果顯示：蜂膠對4種誘變劑的不同類型的基因突變均產(chǎn)生抑制作用，證明蜂膠具有廣譜的抗誘變作用，其抑制基因突變的作用機制可能是對基因突變過程中的多個環(huán)節(jié)產(chǎn)生作用而顯示其抗誘發(fā)活性。 蜂膠除了具有上述的保健作用外，還有抗病毒、護肝、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、改善代謝等作用。 3 蜂膠的臨床應(yīng)用 蜂

43、膠具有抗菌、抗病毒、抗?jié)儭⒖寡住⒔笛獕骸⒃鰪娒庖吡Φ茸饔谩Ｔ诤芏鄧曳淠z被作為民間藥物使用。 3.1 對糖尿病的治療作用糖尿病是最常見的慢性病之一, 在中國的發(fā)病率達到2%, 發(fā)病機理為胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低, 引起蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合癥。目前, 世界上還沒有一種藥物可以根治糖尿病。蜂膠中含有胰蛋白酶等多種活性酶和其他抗病毒物質(zhì), 對恢復(fù)胰臟機能有明顯的作用, 同時, 蜂膠中含有的B 族維生素, 又可能成為胰臟制造胰島素的料。如果蜂膠與蜂王漿合用, 對糖尿病會有更好的療效。3.2 增強免疫力在影響人體健康的諸多因素中, 自身免疫功能失

44、調(diào), 是最核心、最本質(zhì)的因素。蜂膠通過調(diào)節(jié)人體生理功能, 激發(fā)免疫細胞活力和自然殺傷細胞活性, 促使丙種球蛋白增長, 增加抗體產(chǎn)量, 顯著增強免疫能力, 在人體內(nèi)培育抗病力與自愈力。蜂膠增強免疫功能體現(xiàn)在免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視三方面, 即機體對病菌、病毒的抗感染能力, 識別和清除自身衰老的組織細胞的能力, 殺傷和清除異常突變細胞、抑制惡性腫瘤生長的能力。3.3 促進皮膚健康臨床實驗表明: 蜂膠對皮膚瘙癢癥、神經(jīng)性皮炎、射線皮炎、日光性皮炎、毛囊炎、汗腺炎、脂溢性脫發(fā)、斑禿、青年痤瘡等有效; 對物理性皮膚病, 如燒傷、燙傷、凍瘡、手足皸裂有效，有促進傷口愈合與黏附傷口的作用。同時, 蜂膠抗

45、菌消炎作用強, 局部止血止痛快, 能促使上皮組織增生和肉芽生長, 改善皮下組織血液循環(huán), 限制疤痕形成。同時蜂膠對皮膚過敏、皮膚搔癢、頭皮屑、頭皮疹、濕疹、藥癥均有效果。3.4 抑制癌癥的作用蜂膠具有抗癌廣譜性, 能抑制致癌物質(zhì)代謝活性, 增強正常細胞膜活性, 分解癌細胞周圍的纖維蛋白, 防止正常細胞癌變或癌細胞轉(zhuǎn)移。同時蜂膠中含有多種對腫瘤細胞生長有抑制作用的物質(zhì), 其中以櫟精(槲皮素、五羥黃酮)、咖啡酸苯乙酯、clerda 二萜烯、金雀異黃酮和菲瑟酮等化合物的作用最強, 這些成分除了對人類的肝癌細胞有抑制作用, 對人類的宮頸癌細胞和淋巴癌細胞也有作用。亞硝酸胺和黃曲霉素是目前所了解的具有高致癌力的物