1、 細胞總抗氧化能力（TAC）熒光法（ORAC）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）主要用途 細胞總抗氧化能力（TAC）熒光法（ORAC）定量檢測試劑是一種旨在通過使用熒光素探針，受到有機氮自由基AAPH的破壞，但在抗氧化劑的存在下，得到抑制，由此通過熒光分光光度儀，觀察其峰值下降程度的變化，來定量檢測對應于標準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于適用于各種新鮮細胞樣品總抗氧化能力檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化

2、氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；RO

3、S）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如冠心病、風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用熒光素（fluorescein）作為探針，2,

4、2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作為過氧自由基供體（peroxyl radical donor），其攻擊探針，產(chǎn)生熒光淬滅，一旦受到抗氧化劑作用，而防止熒光消失，由此評價抗氧化潛力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在熒光分光光度儀（激發(fā)波長485nm20，散發(fā)波長528nm20）的幫助下，觀察其峰值下降程度的變化，并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） 300毫升 低滲液（Reagent B） 25毫升 緩

5、沖液（Reagent C） 4毫升 染色液（Reagent D） 7.5毫升 氧化液（Reagent E） 1管 標準液（Reagent F） 200微升產(chǎn)品說明書 1份保存方式保存 清理液（Reagent A）、 低滲液（Reagent B）和 緩沖液（Reagent C）在4冰箱里，其余的保存在20冰箱里，避免光照；有效保證6月用戶自備15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器1.5毫升離心管：用于標準樣品配制的容器4（微型）臺式離心機：用于樣品操作細胞刮脫棒：用于脫離細胞超聲儀：用于破碎細胞200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光分析實

6、驗步驟 一、 樣品準備1 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 106細胞）2 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面3 小心抽去清理液4 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）5 加入2毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞6 移入到預冷的2毫升離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）7 放進4臺式離心機離心5分鐘，速度為300g8 小心抽去上清液 9 加入500微升 低滲液（Reagent B），混勻10 置于200瓦超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里11 超聲功率為100，猝擊10秒，2個循環(huán)12 放進4微型臺式離心機離

7、心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）13 移取上清液到新的4預冷的1.5毫升離心管14 移取10微升進行蛋白定量檢測（建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30031.1）15 使用 清理液（Reagent A）調(diào)整蛋白濃度為100微克/25微升16 置于冰槽里待測二、標準液準備1 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管2 分別加入50微升 緩沖液（Reagent C）到2至5號管3 移取100微升 標準液（Reagent F）到1號管，混勻4 小心移取50微升1號管的 標準液（Reagent F）到2號管，混勻5 小心移取50微升2

8、號管稀釋的 標準液（Reagent F）到3號管，混勻6 小心移取50微升3號管稀釋的 標準液（Reagent F）到4號管，混勻7 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表管號 緩沖液（Reagent C） 標準液（Reagent F）測定體系標準 Trolox濃度10100微升1微摩爾/升250微升50微升 0.5微摩爾/升350微升50微升 0.25微摩爾/升450微升50微升 0.125微摩爾/升550微升00三、 樣品測讀實驗開始前，將20冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取1.5毫升 緩沖液（Reagent C）到1管 氧化液（Reagent E）里，混勻，置于暗室里，標

9、記為 氧化工作液，避免光照。然后進行下列操作。1 準備1個黑色96孔板，做好標記：最大對照孔、標準樣品孔、待測樣品孔2 分別移取150微升 染色液（Reagent D）到黑色96孔板里的每個孔里3 加入25微升 緩沖液（Reagent C）到最大對照孔4 加入25微升上述配制的 標準液（Reagent E）到相應標準樣品孔里5 加入25微升樣品（100微克蛋白總量）到待測樣品孔里6 放進37培養(yǎng)箱里孵育30分鐘7 分別加入25微升 氧化工作液到標準樣品孔和待測樣品孔里 8 加入25微升 緩沖液（Reagent C）到最大對照孔9 輕輕搖動黑色96孔板，使其混勻10 放進37培養(yǎng)箱里孵育15分鐘

10、11 即刻放進熒光分光光度儀或熒光酶標儀里測讀：激發(fā)波長485nm20，散發(fā)波長528nm2012 分析結(jié)果：1） 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為熒光單位；橫座標（X軸）為標準Trolox濃度（微摩爾/升）2） 最大對照孔為最大熒光單位讀數(shù)3） 標準樣品孔和待測樣品孔為實際熒光單位讀數(shù) 4） 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）5） 計算樣品實際總抗氧化能力 【根據(jù)標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）X 0.2（體系容量；毫升） X 樣品稀釋倍數(shù)】0.025（樣品容量；毫升）（微摩爾/升TROLOX等值）6） 根據(jù)下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實際抑制百分率）【實際熒光單位讀數(shù)最大對照孔熒光單位讀數(shù)】X 100 7） IC50：50抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品蛋白量（毫克/毫升）或樣品細胞量（106細胞） X（所需樣品單位）（已知樣品單位實際抑制百分率）X 50 注意事項1 本產(chǎn)品為50次操作，包括標準品2 本產(chǎn)品測試范圍為100納摩爾至1微摩爾Trolox等值3 操作時，須戴手套4 樣品制備的所有操作均須在4狀態(tài)下進行5 用戶