1、分離純化工藝原理分離純化工藝原理講 授：譚朝陽郵箱：第一章分離與純化概論第一章分離與純化概論第一節分離純化技術在生物制藥中第一節分離純化技術在生物制藥中的地位的地位如何獲取某種生物藥物的產品？如何獲取某種生物藥物的產品？基因工程、蛋白質工程基因工程、蛋白質工程菌種構建菌種構建上游上游微生物發酵工程微生物發酵工程酶工程酶工程產物積累產物積累中游中游動植物細胞培養工程動植物細胞培養工程分離工程分離工程產物純化產物純化下游下游生物技術下游加工過程生物技術下游加工過程 Downstream Processingl下游加工過程：從發酵液、酶反應液、或動植下游加工過程：從發酵液、酶反應液、或動植物細胞培養

2、液中分離、純化生物產品的過程。物細胞培養液中分離、純化生物產品的過程。l分離純化方法復雜，技術要求高，成本昂貴分離純化方法復雜，技術要求高，成本昂貴l下游加過程的成本：下游加過程的成本：氨基酸：下游投資為發酵部分的氨基酸：下游投資為發酵部分的1.51.5倍倍抗生素：下游投資為發酵部分的抗生素：下游投資為發酵部分的4 4倍倍基因工程藥物（如重組蛋白質）：占整個生產基因工程藥物（如重組蛋白質）：占整個生產費用的費用的80%-90%80%-90%第二節生物技術下游加工過程的特點第二節生物技術下游加工過程的特點一、發酵液（培養液）是復雜的多相體系，含固一、發酵液（培養液）是復雜的多相體系，含固體、液體

3、、氣體、膠狀物質等，多組分的混合體、液體、氣體、膠狀物質等，多組分的混合物物 。l細胞：蛋白質、核酸、多糖、脂類等細胞：蛋白質、核酸、多糖、脂類等l代謝產物：目標產物、中間產物、前體代謝產物：目標產物、中間產物、前體l未用完的培養基未用完的培養基l預處理的添加物預處理的添加物 組分復雜組分復雜(a (a 大分子大分子;b ;b 小分子小分子;c ;c 可溶物可溶物;d ;d 不可溶不可溶物物;e ;e 化學添加物化學添加物二、產物濃度很低二、產物濃度很低幾種典型產品發酵液的濃度幾種典型產品發酵液的濃度典型產品發酵液濃度（g/L)抗生素氨基酸維生素多糖酶蛋白質25100252102010(原因：

4、原因：a 氧傳遞限制；氧傳遞限制；b 細胞量細胞量;c 產物抑制產物抑制三、產物的穩定性差三、產物的穩定性差（1 1）化學降解：溫度、）化學降解：溫度、pHpH值、有機溶劑值、有機溶劑蛋白質：輔助因子、空間構型蛋白質：輔助因子、空間構型手性分子：外消旋手性分子：外消旋（2 2）微生物降解：細胞中存在降解酶）微生物降解：細胞中存在降解酶容易腐敗、染菌、被微生物的活動分解或自身的酶所容易腐敗、染菌、被微生物的活動分解或自身的酶所破壞，機械攪拌、空氣、日光等對生物物質的活性都破壞，機械攪拌、空氣、日光等對生物物質的活性都會發生影響。會發生影響。措施：低溫、快速操作（時間短），措施：低溫、快速操作（時

5、間短），pHpH適中、勤洗消適中、勤洗消毒（防止染菌污染）等毒（防止染菌污染）等四、四、分批操作，生物變異性大分批操作，生物變異性大l生物材料組分數量大，分離困難生物材料組分數量大，分離困難l目標產物與雜質的理化性質如溶解度、相對分目標產物與雜質的理化性質如溶解度、相對分子量、等電點都十分相近，分離與純化比較困子量、等電點都十分相近，分離與純化比較困難難五、終產品的質量要求很高五、終產品的質量要求很高l青霉素：青霉噻唑蛋白青霉素：青霉噻唑蛋白RIA值（放射免疫分析值（放射免疫分析值）值）100（相當于（相當于1.5106）l蛋白質藥物：雜蛋白蛋白質藥物：雜蛋白2%l重組胰島素：雜蛋白重組胰島素

6、：雜蛋白0.01%收率低、成本高收率低、成本高l穩定性差，收率低，損失大穩定性差，收率低，損失大l分離純化方法復雜、昂貴分離純化方法復雜、昂貴l下游加過程的成本：下游加過程的成本：氨基酸：下游投資為發酵部分的氨基酸：下游投資為發酵部分的1.51.5倍倍抗生素：下游投資為發酵部分的抗生素：下游投資為發酵部分的4 4倍倍基因工程藥物（如重組蛋白質）：占整個生產基因工程藥物（如重組蛋白質）：占整個生產費用的費用的80%80%90%90%生物技術下游加工過程特點生物技術下游加工過程特點第三節傳統生物產品的分離純化方法第三節傳統生物產品的分離純化方法l分離純化可分四個階段：1 1、發酵液的預處理和固液分

7、離、發酵液的預處理和固液分離2 2、初步分離（提取）、初步分離（提取）3 3、高度純化（精制）、高度純化（精制）4 4、成品加工、成品加工 細胞回收細胞回收技術技術: 絮凝，離心，過濾，微過濾。絮凝，離心，過濾，微過濾。 細胞破碎細胞破碎技術技術: 球磨，高壓勻漿，化學破碎技術球磨，高壓勻漿，化學破碎技術 初步純化初步純化技術技術: 吸附劑，離子交換，沉淀（鹽析吸附劑，離子交換，沉淀（鹽析 法，有機溶劑沉淀，等電點，沉淀劑），溶劑萃法，有機溶劑沉淀，等電點，沉淀劑），溶劑萃 取，兩水相萃取，超臨界萃取，逆膠束萃取，膜取，兩水相萃取，超臨界萃取，逆膠束萃取，膜 分離技術分離技術 高度純化高度純化

8、技術技術: 各類層析，親和，疏水，聚焦，離各類層析，親和，疏水，聚焦，離 子交換，結晶子交換，結晶 成品加工成品加工：濃縮，除菌與熱原，噴霧干燥，氣流干：濃縮，除菌與熱原，噴霧干燥，氣流干 燥，沸騰干燥，冷凍燥燥，沸騰干燥，冷凍燥分離純化的一般工藝流程分離純化的一般工藝流程單元操作單元操作1 1、發酵液的預處理和固液分離、發酵液的預處理和固液分離發酵液預處理的目的在于改變發酵液的性質，以利于發酵液預處理的目的在于改變發酵液的性質，以利于固液分離。固液分離。 降低發酵液的黏度：酸化、加熱等降低發酵液的黏度：酸化、加熱等凝聚和絮凝技術：聚結成較大顆粒，加速固液分離凝聚和絮凝技術：聚結成較大顆粒，加

9、速固液分離固液分離固液分離固液分離基本的單元操作：過濾和離心固液分離基本的單元操作：過濾和離心錯流膜過濾技術：減少過濾介質阻力錯流膜過濾技術：減少過濾介質阻力l板框壓濾機板框壓濾機l鼓式真空過濾機：較粗的真菌菌絲體鼓式真空過濾機：較粗的真菌菌絲體l傾析式離心機：含固體量較多的發酵液傾析式離心機：含固體量較多的發酵液細胞破碎和碎片分離細胞破碎和碎片分離如產物在細胞內，還要進行細胞破碎如產物在細胞內，還要進行細胞破碎高壓勻漿器高壓勻漿器：利用液相剪切力與固定表面撞擊：利用液相剪切力與固定表面撞擊所產生的力。所產生的力。高速球磨機高速球磨機：研磨：研磨實驗室還可用化學、酶解、干燥等方法實驗室還可用化

10、學、酶解、干燥等方法碎片分離：離心、雙水相萃取碎片分離：離心、雙水相萃取單元操作單元操作2 2、初步分離（提取）：、初步分離（提取）：除去與產物性質差異大除去與產物性質差異大的雜質，使產物濃度和質量提高。的雜質，使產物濃度和質量提高。可選范圍廣：吸附、萃取、沉淀等可選范圍廣：吸附、萃取、沉淀等3 3、高度純化（精制）：、高度純化（精制）：與（與（2 2）類似）類似層析、電泳等層析、電泳等4 4、成品加工：、成品加工：濃縮、結晶、干燥等濃縮、結晶、干燥等溶劑萃取法溶劑萃取法l目標產物不同的化學狀態存在時，在水中及與目標產物不同的化學狀態存在時，在水中及與水不互溶的溶劑中有不同的溶解度。水不互溶的

11、溶劑中有不同的溶解度。l青霉素在酸性下成游離酸，在醋酸丁酯中溶解度較大，青霉素在酸性下成游離酸，在醋酸丁酯中溶解度較大，使之從發酵液中轉移到醋酸丁酯相中。使之從發酵液中轉移到醋酸丁酯相中。在中性成鹽的條件下，在水中溶解度大，再從醋酸丁在中性成鹽的條件下，在水中溶解度大，再從醋酸丁酯中轉移至水相。酯中轉移至水相。離子交換分離法離子交換分離法l利用離子交換樹脂和目標產物之間的化學親和利用離子交換樹脂和目標產物之間的化學親和力（電荷），有選擇性地將產物吸附上去，然力（電荷），有選擇性地將產物吸附上去，然后改變條件將其洗脫下來，以達到濃縮和提純后改變條件將其洗脫下來，以達到濃縮和提純目的。目的。吸附分

12、離法吸附分離法l利用吸附劑與產物之間的分子引力將產物吸附利用吸附劑與產物之間的分子引力將產物吸附在吸附劑上，再選用洗脫劑將其洗脫下來。在吸附劑上，再選用洗脫劑將其洗脫下來。l活性炭、硅膠、氧化鋁、大孔吸附樹脂活性炭、硅膠、氧化鋁、大孔吸附樹脂l選擇性較差、可逆性較差、勞動強度大選擇性較差、可逆性較差、勞動強度大沉淀分離法沉淀分離法l加入一些無機或有機離子或整個分子，能與目加入一些無機或有機離子或整個分子，能與目標產物形成不溶解的鹽或復合物而自發酵液中標產物形成不溶解的鹽或復合物而自發酵液中沉淀出來。沉淀出來。l發酵單位越高，利用沉淀分離法越有利，因為發酵單位越高，利用沉淀分離法越有利，因為收率

13、越高（溶液中的殘留量是一定的）收率越高（溶液中的殘留量是一定的）化學萃取法化學萃取法l在液液萃取過程中常伴有化學反應，包括相在液液萃取過程中常伴有化學反應，包括相內反應與相界面上的反應。內反應與相界面上的反應。絡合反應絡合反應陽離子交換反應陽離子交換反應離子締合反應離子締合反應協同反應協同反應帶同萃取反應帶同萃取反應超臨界流體萃取法超臨界流體萃取法l在較高壓力下，液相與氣相的物理性質（如密在較高壓力下，液相與氣相的物理性質（如密度、黏度等）差別逐漸縮小，到某一點時（臨度、黏度等）差別逐漸縮小，到某一點時（臨界點）消失，合并為一相，稱為界點）消失，合并為一相，稱為超臨界流體超臨界流體。l超臨界流

14、體：密度大（同液體），擴散速度快超臨界流體：密度大（同液體），擴散速度快（同氣體），萃取能力強。（同氣體），萃取能力強。l常用常用二氧化碳二氧化碳作為萃取劑。作為萃取劑。l夾帶劑（極性溶劑）改善對極性物質的萃取能夾帶劑（極性溶劑）改善對極性物質的萃取能力。力。膜分離法膜分離法l利用一定截留分子量的超濾膜進行溶質的分離利用一定截留分子量的超濾膜進行溶質的分離或濃縮。小于截留值的分子通過膜，大于截留或濃縮。小于截留值的分子通過膜，大于截留值的分子不能通過膜。值的分子不能通過膜。l能耗少，無污染。能耗少，無污染。l缺點：濃差極化、膜的污染、壽命較短、通量缺點：濃差極化、膜的污染、壽命較短、通量低。低

15、。第四節現代生物藥物的分離純化第四節現代生物藥物的分離純化 l基因工程藥物：多數通過基因工程藥物：多數通過重組微生物重組微生物得到。得到。l動物細胞培養動物細胞培養：單克隆抗體、疫苗、激素、免：單克隆抗體、疫苗、激素、免疫調節劑等疫調節劑等l特點：特點：（1 1）有效成分含量低：有效成分含量低：5 550ug/ml50ug/ml（2 2）產品純度要求很高）產品純度要求很高: :雜蛋白雜蛋白100ppm100ppm傳統生物產品與基因工程產品回收方法的比較傳統生物產品與基因工程產品回收方法的比較l傳統產品傳統產品 l(1) (1) 小分子（少數工業用粗酶）小分子（少數工業用粗酶）l(2) (2)

16、理化性質清楚理化性質清楚l(3) (3) 易于放大易于放大l基因產品基因產品l(1) (1) 大分子大分子l(2) (2) 胞內胞內l(3) (3) 不穩定不穩定l(4) (4) 放大困難放大困難一、初步分離方法一、初步分離方法 l胞內產物：細胞破碎胞內產物：細胞破碎去核酸：聚乙烯亞胺沉淀去核酸：聚乙烯亞胺沉淀蛋白質形成不溶解的包含體，先變性，再折疊蛋白質形成不溶解的包含體，先變性，再折疊成天然形式成天然形式l動物細胞培養：分泌在培養液中，不要破碎細動物細胞培養：分泌在培養液中，不要破碎細胞，但濃度很稀，要濃縮。可采用膜濃縮或硫胞，但濃度很稀，要濃縮。可采用膜濃縮或硫酸銨沉淀法濃縮。酸銨沉淀法

17、濃縮。（一）沉淀分離法（一）沉淀分離法 （1 1）鹽析：高濃度鹽破壞蛋白質分子水化層，）鹽析：高濃度鹽破壞蛋白質分子水化層，使蛋白質沉淀。使蛋白質沉淀。（2 2）加入有機溶劑：降低溶液的介電常數，使）加入有機溶劑：降低溶液的介電常數，使水分子溶解能力降低。水分子溶解能力降低。（3 3）調）調pHpH至等電點：沉淀能力不強，可同時加至等電點：沉淀能力不強，可同時加入有機溶劑入有機溶劑（4 4）加入非離子型聚合物：如聚乙二醇（）加入非離子型聚合物：如聚乙二醇（PEGPEG）（5 5）加入聚電解質：如聚丙烯酸）加入聚電解質：如聚丙烯酸（二）雙水相萃取（二）雙水相萃取l僅適用于蛋白質的分離。僅適用于蛋

18、白質的分離。l聚合物分子的不相容性，兩種聚合物的水溶液聚合物分子的不相容性，兩種聚合物的水溶液可分為兩相。可分為兩相。l如如PEGPEG與葡聚糖的水溶液與葡聚糖的水溶液二、高度純化方法二、高度純化方法（一）色譜法：適合分離大分子物質（一）色譜法：適合分離大分子物質色譜柱中形成固定相和移動相，物質在兩相間分配情況色譜柱中形成固定相和移動相，物質在兩相間分配情況不同，使得在柱中的運動速度不同而分離。不同，使得在柱中的運動速度不同而分離。方法機制分離能力容量離子交換層析吸附層析聚焦層析疏水層析親和層析金屬螯合層析電荷和離解度范德華力、氫鍵等電點表面自由能特殊的生物作用力金屬螯合很高高很高高優異高很大

19、小大大很大大（二）結晶和重結晶（二）結晶和重結晶l適用于小分子物質適用于小分子物質l先決條件是：溶液達到過飽和先決條件是：溶液達到過飽和l可采用的方法：冷卻、蒸發、加入反應劑、等可采用的方法：冷卻、蒸發、加入反應劑、等電點、鹽析、共沸蒸餾電點、鹽析、共沸蒸餾三、成品加工三、成品加工（一）濃縮（一）濃縮薄膜蒸發（薄膜蒸發（1min1min）離心薄膜蒸發器（離心薄膜蒸發器（1 110s10s）：適用熱敏性物質）：適用熱敏性物質（二）無菌過濾和去熱原：（二）無菌過濾和去熱原：超濾（對小分子物質）超濾（對小分子物質）陰離子交換（對大分子蛋白質）陰離子交換（對大分子蛋白質）（三）干燥（三）干燥對熱敏物質

20、（噴霧干燥和冷凍干燥）對熱敏物質（噴霧干燥和冷凍干燥）非蛋白類雜質的去除非蛋白類雜質的去除（1 1） DNA DNA A A 陰離子交換（陰離子交換（pH 4.0)pH 4.0) B B 親和層析（不被吸附）親和層析（不被吸附） C C 疏水層析疏水層析（2 2）熱原熱原 （蛋白質溶液中的去熱原）（蛋白質溶液中的去熱原） A A 生產過程無菌生產過程無菌 B B 所有層析介質無菌所有層析介質無菌 C C 所用溶液無菌所用溶液無菌 D D 親和層析（多粘菌素）親和層析（多粘菌素）（3 3）去病毒去病毒 A A 加熱加熱 （60 C)60 C) B B 過濾過濾 C C 滅活劑滅活劑第五節下游加工

21、過程的選擇準則第五節下游加工過程的選擇準則高產率、低成本高產率、低成本一、步驟盡量少一、步驟盡量少每步回收率每步回收率90%90%，共六步，則總收率只有，共六步，則總收率只有0.90.96 654%54%。基因工程蛋白質能達到基因工程蛋白質能達到303040%40%就很好了就很好了二、采用步驟的次序要相對合理二、采用步驟的次序要相對合理l沉淀：能大量處理物質，且受干擾影響小，放在工藝流程前段。l離子交換：除去對后續分離產生影響的化合物l親和技術：常在流程后階段，以避免因非專一作用引起親和系統性能降低。l凝膠過濾：容量較小，處理量少，最后一道處理中，進行脫鹽等三、其他考慮因素三、其他考慮因素（1

22、 1）產品的規格：診斷用、口服藥、注射藥等）產品的規格：診斷用、口服藥、注射藥等（2 2）生產規模：決定所采用的方法，或增加多）生產規模：決定所采用的方法，或增加多臺設備臺設備（3 3）進料組成：胞內、胞外、可溶性、發酵液）進料組成：胞內、胞外、可溶性、發酵液的濃度、黏度等的濃度、黏度等（4 4）產品的形式：溶液、粉末、晶體形態）產品的形式：溶液、粉末、晶體形態（5 5）產品的穩定性）產品的穩定性（6 6）物理性質：溶解度、分子電荷、分子大小、）物理性質：溶解度、分子電荷、分子大小、功能團、穩定性、揮發性功能團、穩定性、揮發性目標成分與雜質之間的理化性質差異越大，其分離效目標成分與雜質之間的理

23、化性質差異越大，其分離效果越好。果越好。（7 7）危害性：有機溶劑、重組）危害性：有機溶劑、重組DNADNA工程菌菌體的工程菌菌體的處理、處理用的化學品處理、處理用的化學品（8 8）廢水：）廢水：（9 9）分批或連續操作）分批或連續操作分離純化的目的以最簡單有效的技術，以最簡單有效的技術， 最少的步驟，最少的步驟， 最高的收率，最高的收率， 最低的成本，最低的成本， 生產合格產物。生產合格產物。分離純化方法的選擇依據分離純化方法的選擇依據一、生物藥物的理化性質一、生物藥物的理化性質極性還是非極性，極性化合物進一步確定其酸性、堿極性還是非極性，極性化合物進一步確定其酸性、堿性或兩性，以及酸堿性的

24、強弱。在各種溶劑中的溶解性或兩性，以及酸堿性的強弱。在各種溶劑中的溶解度，度，pHpH、溫度、其他鹽類對其溶解度的影響等。、溫度、其他鹽類對其溶解度的影響等。二、生物藥物的穩定性二、生物藥物的穩定性合適的合適的pHpH和溫度范圍和溫度范圍三、極性和溶解度三、極性和溶解度新藥物的極性確定：紙層析法和紙電泳法新藥物的極性確定：紙層析法和紙電泳法紙層析法紙層析法l濾紙為載體，吸附的水分是固定相，另一溶劑濾紙為載體，吸附的水分是固定相，另一溶劑為移動相，使物質在兩相間不斷分配。為移動相，使物質在兩相間不斷分配。l極性物質在極性強的溶劑中極性物質在極性強的溶劑中RfRf值較大值較大l非極性物質在非極性溶

25、劑中非極性物質在非極性溶劑中RfRf值較大值較大l利用八種溶劑系統的紙層析數據決定物質的利用八種溶劑系統的紙層析數據決定物質的極極性和溶解性性和溶解性。lpH-pH-紙層析法研究物質的離解性能。紙層析法研究物質的離解性能。紙電泳法紙電泳法l判斷物質的電離性質。判斷物質的電離性質。l不同的物質由于帶電性質、電荷數量以及分子不同的物質由于帶電性質、電荷數量以及分子量大小不同，在一定時間內在電場作用下，移量大小不同，在一定時間內在電場作用下，移動的方向和距離是不同的。動的方向和距離是不同的。l堿性物質：帶正電荷，電泳時移向負極堿性物質：帶正電荷，電泳時移向負極l酸性物質：帶負電荷，電泳時移向正極酸性物質：帶負電荷，電泳時移向正極l中性物質：電泳時不移動中性物質：電泳時不移動l兩性物質：移動方