1、www.CRTER.org李根林，等. 復方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對腸道菌群的影響復方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對腸道菌群的影響李根林，張顏語，李寒冰(河南中醫藥大學，河南省鄭州市 450046)引用本文：李根林，張顏語，李寒冰. 復方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對腸道菌群的影響J.中國組織工程研究，2016，20(49): 7404-7410.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.016 ORCID: 0000-0001-6943-2539(李寒冰)文章快速閱讀：便秘大鼠腸道菌群嚴重紊亂李根林，男，1963年生，河南省鄭州市人，漢族，碩士，教授，碩士生

2、導師，執業藥師，執業醫師，主要研究方向有中藥抗衰老研究、中醫藥用于骨傷病的臨床與實驗研究等。通訊作者：李寒冰，博士，副教授，碩士生導師，執業藥師，河南省新藥審評專家，河南中醫藥大學，河南省鄭州市 450046中圖分類號:R318文獻標識碼:B文章編號:2095-4344(2016)49-07404-07稿件接受：2016-10-13復方地芬諾酯便秘模型結腸常規病理觀察盲腸內容物細菌16S rDNA的V3區進行PCR-DGGE糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌變化，盲腸內容物檢查體質量、糞便粒量、糞便含水量、腸道內容物所占百分比、腸道張力整體指標腸道菌群綜合 分析便秘與腸道菌群變化之間的關聯 文

3、題釋義：便秘：是指排便困難或費力、排便不暢、便次太少、糞便干結且量少。主要原因有習慣性忽略排便感覺、排便肌軟弱無力、肛門擴約肌痙攣、腸蠕動遲緩、腸痙攣、腸梗阻、缺少體力活動等。急性便秘常由于腸梗阻、腸麻痹、急性腹膜炎、腦卒中、急性心肌梗死、肛周疼痛性疾病等引起；慢性便秘常由于慢性機械性腸梗阻或腸蠕動功能失調所致，如腸腫瘤、腸粘連、腸易激綜合征等。便秘患者可表現為每周排便少于3次，或雖然每日排便多次，但排便相當費力，每次排便所費時間相當長，排出糞便干結如羊糞且數量少，排便后仍有糞便未排盡的感覺。地芬諾酯：是哌替啶的衍生物，代替阿片制劑。對腸道作用類似嗎啡，直接作用于腸平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器

4、，消除局部黏膜的蠕動反射而減弱蠕動，同時可增加腸的節段性收縮，從而延長腸內容物與腸黏膜的接觸，促進腸內水分的回吸收。摘要背景：既往研究中檢測便秘模型的指標多為糞便粒數、腸道張力變化等整體指標，很少涉及腸道菌群的變化。目的：以復方地芬諾酯建立便秘大鼠模型探索便秘對大鼠腸道張力、病理及微生態等方面的影響。方法：20只SPF級Wistar大鼠隨機分為空白組和模型組，分別連續20 d灌胃10 mg/kg的復方地芬諾酯和蒸餾水。結果與結論：與空白組相比，給藥20 d，模型組大鼠回腸收縮頻率降低，24 h排便量減少，盲腸內容物中細菌種群結構存在變化，結腸結構嚴重破壞。結果表明，便秘大鼠腸道菌群嚴重紊亂。關

5、鍵詞：實驗動物；消化系統損傷與修復動物模型；腸道菌群紊亂；便秘大鼠；復方地芬諾酯；腸道張力；大腸桿菌；雙歧桿菌；乳酸桿菌；國家自然科學基金主題詞：便秘；地芬諾酯；腸桿菌科；組織工程基金資助：國家自然基金面上項目(81473435)；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃(2013GGJS-092)；河南中醫藥大學研究生苗圃計劃(MP2015-89)7405 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Effect of constipation induced by diphenoxylate on intestinal flora in a ratLi Gen-

6、lin, Zhang Yan-yu, Li Han-bing (Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: In the previous studies, the overall index in constipation models, such as fecal output in 24 hours and intestinal tension are usually measured. However, the changes of i

7、ntestinal flora are rarely involved. OBJECTIVE: To explore the effect of constipation on intestinal tension, pathology and microecology in the rat models of diphenoxylate-induced constipation. METHODS: Twenty SPF Wistar rats were randomly divided into blank control and model groups, followed by give

8、n 10 mg/kg diphenoxylate and distilled water by gavage once daily for 20 days, respectively. RESULTS AND CONCLUSION: Twenty days later, compared with the blank control group, the frequency of ileum contraction was decreased, 24-hour stool decreased, the ratio of bacteria group in the cecum changed,

9、and structure of the colon was seriously damaged in the model group. These results suggest that constipation results in the intestinal flora disturbance remarkablely.Subject headings: Constipation; Diphenoxylate; Enterobacteriaceae; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation

10、of China, No. 81473435; the Fund for the Young Talent Teacher in High Educations of Henan Province, No. 2013GGJS-092; the Nursery Plan for the Postgraduate of Henan University of Chinese Medicine, No. MP2015-89Cite this article: Li GL, Zhang YY, Li HB. Effect of constipation induced by diphenoxylate

11、 on intestinal flora in a rat. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(49):7404-7410.Li Gen-lin, Master, Professor, Masters supervisor, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, ChinaCorresponding author: Li Han-bing, M.D., Associate professor, Masters supervisor, Hena

12、n University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China7409ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction便秘是一種臨床常見疾病，成因繁多，治療效果不佳。目前常采用由鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品組成的臨床常用緩瀉藥復方地芬諾酯建立便秘的動物模型，該方法具有造模簡單、方法可靠、重復性高等優點，謝培等1復制的便秘模型周期長達45 d，亦有周期短、劑量大，而有動物死亡現象，在指標測定上多集中于糞便粒數、腸道張力變化等整體指標1-2，很少涉及腸

13、道菌群的變化。目前，已知腸道菌群的失衡與許多疾病的發生、發展有著密不可分的關系，如腸易激綜合征、抑郁癥、肥胖等3-5。也有報道稱人群中不同原因形成的便秘會對腸道菌群產生復雜的影響，同時腸道菌群結構的紊亂又會影響便秘的發展6-7。為了深入了解復方地芬諾酯造便秘模型的特點并探索造模后腸道菌群的變化特征，作者對復方地芬諾酯造便秘模型大鼠進行研究，在測定24 h糞便粒數、腸道張力等指標的基礎上，結合新鮮糞便的細菌傳統培養及盲腸內容物革蘭氏染色來初步表征腸道菌群的桿球菌變化，并利用聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳對腸道菌基因組保守區域亦被認為是“分子鐘”的16S rDNA進行基因片段擴增分析8，以期完善

14、復方地芬諾酯的造模方法并為該便秘模型與腸道菌群變化之間的關聯提供參考和依據。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設計 隨機對照動物實驗。1.2 時間及地點 實驗于2015年3至5月在河南中醫藥大學科研處科研實驗中心完成。1.3 材料實驗動物：SPF級Wistar大鼠20只，鼠齡7周，雌雄各半，體質量(180±20) g，購于山東省魯抗醫藥股份公司，許可證號：SCXK魯20130001；適應性飼養于河南中醫藥大學科研處科研實驗中心SPF級動物房5 d。整個實驗過程中，動物自由飲水和取食。主要試劑及儀器：復方地芬諾酯片(含鹽酸地芬諾酯2.5 mg，硫酸阿托

15、品0.025 mg，產品批號1406005)，購自常州康普藥業有限公司；四甲基乙二胺購自北京索萊寶科技有限公司，貨號816B026；雙歧桿菌瓊脂培養基(產品編號HB0396-1)和乳酸桿菌選擇性培養基(產品編號HB0385-1)均購于青島高科園海博生物技術有限公司；蛋白胨(產品編號01-001)和瓊脂粉(產品編號01-023)均購于北京奧博星生物技術有限責任公司；革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，產品批號20151209，糞便基因組DNA快速提取試劑盒購自艾德萊，貨號DN23；Multiplex PCR Assay Kit Ver.2購自TaKaRa，貨號RR062A；高壓滅菌鍋LD

16、ZX-30KB購自上海申安醫療器械廠；PHS-100生化培養箱購自中科生命科技股份有限公司；SW-CJ 超凈工作臺購自蘇州蘇潔凈化設備有限公司；IS-6800培清全自動凝膠成像系統購自上海培清有限科技公司；多功能 PCR儀購自賽默飛公司；瓊脂凝膠電泳儀、Dcode DGGE電泳儀均購自美國伯樂公司；全自動脫水機、石蠟包埋機及全自動切片機購自LEICA公司；全自動顯微鏡購自OLYMPUS公司；BL-420F生物機能實驗系統購自成都泰盟軟件有限公司；超純水儀購自上海茸研儀器。1.4 方法1.4.1 便秘模型的制備 20只Wistar大鼠隨機分為空白組和模型組，各10只，每天上午9：00稱體質量。模

17、型組每天灌胃復方地芬諾酯10 mg/kg，連續20 d；空白組給予相同體積的蒸餾水。1.4.2 常規指標的測定 實驗過程中，每天稱取大鼠體質量，并計算大鼠體質量的日變化量；體質量日變化量=第N天體質量-第(N-1)天體質量。在實驗給藥過程中，分別收集每只大鼠第0，7，14，20天的24 h糞便量。給藥20 d后，摘眼球取血后，直接處死大鼠，立即取大鼠胃噴門至直腸末端腸道，各截取一段1 cm左右長度的十二指腸和回腸，采用BL-420F生物機能實驗系統測量腸道張力。剩余腸道稱質量記為腸道總質量，縱向切開用PBS清洗干凈腸壁，濾紙吸干水分后，再次稱取腸道凈質量，二者差值為腸道內容物總質量，計算腸道內

18、容物百分比。內容物百分比=(腸道總質量-腸道凈質量)/腸道總質量×100%1.4.3 腸道菌群指標測定新鮮糞便細菌計數：分別于給藥后1，6，11，16，20 d，將大鼠置于干凈無菌的代謝籠內，收集大鼠的新鮮糞便約0.1 g，于無菌無酶的試管中，進行10倍梯度稀釋，篩選出1×10-7稀釋倍數的菌液，分別接種到大腸桿菌培養基、雙歧桿菌瓊脂培養基、乳酸桿菌培養基，37 恒溫培養，其中大腸桿菌培養24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌在自制厭氧罐內培養48 h后，進行計數9。腸道菌群比例變化及種類分析：革蘭氏染色法測盲腸內容物菌群比例變化10，并用糞便細菌基因提取試劑盒提取盲腸內容物細菌總D

19、NA，以16S rRNA基因可變區V3區為靶標11，進行PCR擴增，上游引物序列為357F：5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'，下游引物序列為518r：5-ATT ACC GCG GCT GCTGG-3'(下劃線部分為40個GC堿基對，作為GC夾，為擴增產物制造高溫解鏈區)，擴增體系為：2×Multiplex PCR Buffer(25 L)，模版DNA(1 L)、引物(10 mol/L，各1 L)、滅菌超純水補足50 L。PCR反

20、應在Thermo PCR儀上進行。擴增條件為：94 預變性3 min；95 變性30 s；55 退火30 s；72 延伸20 s；72 延伸7 min，并進行30個循環，終止于4 。PCR擴增產物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(110 V， 20 min)。擴增產物進行變性凝膠梯度電泳以分析腸道菌群種類變化，全自動凝膠成像系統觀察。1.4.4 病理觀察 給藥20 d后，立即迅速取大鼠近端結腸2 cm，剔除管壁周圍的脂肪組織，PBS洗，中性甲醛固定，蘇木精-伊紅染色12，100倍的視野內使用Image pro-Plus6.0圖像分析系統對隱窩深度進行測量定量分析。并采用結腸病理組織學指數評分標準對

21、結腸病理切片進行評價13。結腸病理組織學指數=炎癥細胞浸潤程度評分+杯狀細胞損壞評分情況+病變深度評分。其中評價標準見表1：表1 結腸病理組織學指數評分標準Table 1 Scoring criteria of the histopathological index of colon炎癥細胞浸潤程度杯狀細胞損壞情況病變深度得分無單核細胞浸潤無損壞無0 固有層局部或多個位點有巨噬細胞、中性粒細胞浸潤局部丟失僅限于黏膜層1 炎性浸潤在固有層呈連續分布，并蔓延至黏膜下層多個位點丟失，但仍有正常上皮黏膜層、黏膜下層2固有層、黏膜下層均有明顯浸潤，并在黏膜下層呈連續分布大量消失波及肌層3 全層均有單核細

22、胞、中性粒細胞、淋巴細胞嚴重透壁浸潤全被損壞全層4 1.5 主要觀察指標 常規指標測定：測定大鼠體質量及其體質量日變化量、十二指腸及回腸腸道張力變化、腸道中內容物所占整個腸道質量的百分比變化、大鼠24 h排便量；腸道菌群相關指標：采用傳統平板計數法測定糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌變化、采用革蘭氏染色法以及聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳法檢測大鼠盲腸內容物中菌群的變化；采用蘇木精-伊紅染色檢測大鼠結腸病理變化。1.6 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析處理，采用非參檢驗方法對結腸病理組織學指數評分結果進行比較，其余數據采用獨立樣本t 檢驗進行比較。P < 0.

23、05為差異有顯著性意義，P < 0.01為差異有非常顯著性意義。2 結果 Results2.1 實驗動物數量分析 所有大鼠均進入結果分析，無脫失。2.2 體質量及日變化量 與空白組相比，模型組大鼠體質量及日變化量略有升高，但差異無顯著性意義(t0.05=0.344，P > 0.05；t0.05=1.178，P > 0.05；圖1)。2.3 十二指腸及回腸腸道張力 與空白組相比，造模結束時，模型組大鼠十二指腸腸道張力差異無顯著性意義(P > 0.05；圖2 A，B，表2)；而回腸腸道頻率顯著降低(t0.05=5.27，P < 0.01；圖2C，D，表2)，表明造模便

24、秘大鼠在小腸部位并未出現嚴重的病理表現，而回腸蠕動的頻率降低，可能會導致食物在腸道內滯留。表2 便秘對大鼠腸道張力相關指標的影響 (±s，n=10)Table 2 Effect of constipation on the intestinal tension of rats表注：與空白組相比，aP < 0.05。項目空白組模型組十二指腸張力頻率(n/min)26.20±3.6827.67±4.69最大值(g)0.24±0.220.19±0.13最小值(g)-0.24±0.22-0.15±0.09平均值(g)-0.00

25、±0.01-0.00±0.01峰峰值(g)0.47±0.440.34±0.22面積(g×s)1.45±1.551.19±0.48回腸張力頻率(n/min)32.06±8.4522.98±4.37a最大值(g)1.63±0.981.62±1.10最小值(g)-1.48±0.71-1.46±1.06平均值(g)-0.02±0.01-0.03±0.02峰峰值(g)3.12±1.693.18±2.21面積(g×s)9.32&

26、#177;6.049.48±5.882.4 腸道內容物百分比 給藥20 d后，與空白組相比，模型組大鼠腸道內容物百分比有所增加，但差異無顯著性意義(t0.05=1.29，P > 0.05；圖3)。2.5 腸道菌群2.5.1 24 h糞便量以及新鮮糞便細菌計數結果 與空白組相比，給藥14，20 d后，模型組大鼠24 h排便量明顯減少(t0.05=2.203，P < 0.05；t0.05=5.428，P < 0.01；圖4A)；給藥6 d后，模型組腸道內大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌含量無明顯變化(t0.05=0.118，P > 0.05；t0.05=0.417，P

27、 > 0.05；t0.05=1.492，P > 0.05)，給藥20 d后，模型組大鼠的新鮮糞便中大腸桿菌略有增多，但差異仍無顯著性意義(t0.05=0.647，P > 0.05，圖4B)，而雙歧桿菌增多(t0.05=3.159，P < 0.05；圖4C)，乳酸桿菌含量顯著降低(t0.05=7.149，P < 0.01；圖4D)。2.5.2 盲腸內容物 采用革蘭氏染色方法檢測大鼠盲腸內容物中細菌變化。與空白組相比，在給藥20 d后，模型便秘大鼠盲腸內革蘭陽性/陰性細菌數量降低(t0.05=1.921，P < 0.05)，且桿菌/球菌比值下降(t0.05=2.

28、030，P < 0.05；圖5，表3)，表明盲腸內菌群結構發生紊亂。表3 便秘對大鼠盲腸內容物中菌類比例的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of constipation on the ratio of different bacteria species in the cecal contents of rats項目空白組模型組革蘭陽性菌(%)桿菌22.03±6.9014.35±4.67球菌24.52±6.426.43±11.37革蘭陰性菌(%)桿菌26.26±6.820.13±9.38球菌27.2

29、0±9.6639.08±10.96b革蘭陽性菌/革蘭陰性菌0.97±0.450.75±0.11a桿菌/球菌1.24±0.420.71±0.53a表注：與空白組相比，aP < 0.05，bP < 0.01。2.5.3 盲腸內容物細菌變化 與空白組相比，模型組便秘大鼠盲腸內容物中細菌種群結構存在變化，便秘大鼠盲腸內細菌總量明顯減少，部分菌屬增多，同時又有某些種屬的菌群丟失或者是菌群豐度至檢測到的最低限度(圖6)。2.6 結腸病理變化 與空白組相比，模型組大鼠結腸隱窩深度變淺(t0.05=6.185，P < 0.01)，結

30、腸結構損傷嚴重，杯狀細胞大面積缺失，炎性浸潤在固有層呈連續分布，并蔓延至黏膜下層，結腸病理組織學指數明顯上升(P < 0.01；圖7，表4)。表4 便秘對大鼠結腸結構的影響 (±s，n=10)Table 4 Effect of constipation on the structure of colon in rats組別隱窩深度(m)結腸病理組織學指數空白組68.50±13.150.95±0.89模型組39.55±8.72a10.30±2.87a表注：與空白組相比，aP < 0.01。3 討論 Discussion復方地芬諾酯中所

31、含的鹽酸地芬諾酯口服吸收后，能夠抑制腸道蠕動，使腸道分泌物減少，為臨床常用抗腹瀉藥。謝培等1研究表明30 mg/kg高劑量給予復方地芬諾酯，造模周期短，但死亡率高，而8 mg/kg低劑量體質量日變化量(g)BA40036032028024020020151050-5-10-15圖1 便秘對大鼠體質量及體質量日變化量的影響Figure 1 Effects of constipation on the body weight and daily cumulative change in body weight of rats in each group圖注：圖中A為體質量；B為體質量日變化量。空白

32、組與模型組大鼠體質量及日變化量接近。空白組模型組空白組模型組體質量(g)1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 201 4 8 12 16 20CDAB給藥后時間(d)給藥后時間(d)0.150.100-0.10-0.15-50.100.050-0.05-0.10-0.10-0.1-0.2-0.3-0.5-0.6-0.20-0.2-0.4-0.6頻率：20次/min 最大值：0.77 g 最小值：-0.73 g 平均值：0.05 g頻率：33次/min 最大值：0.66 g 最小值：-0.69 g 平均值：

33、0.01 g頻率：32次/min 最大值：0.17 g 最小值：-0.15 g 平均值：0.01 g頻率：32次/min 最大值：0.17 g 最小值：-0.17 g 平均值：0.00 g圖2 便秘對大鼠十二指腸及回腸腸道張力的影響Figure 2 Effects of constipation on the intestinal tension in the duodenum and ileum of rats in each group圖注：圖中A，B為空白組和模型組大鼠十二指腸的腸道張力情況；C，D為空白組和模型組大鼠回腸的腸道張力情況。模型組大鼠回腸蠕動的頻率降低。模型組空白組腸道內容

34、物所占百分比(%)圖3 便秘對大鼠腸道內容物百分比的影響Figure 3 Effect of constipation on the percentage of intestinal contents of rats in each group圖注：兩組大鼠腸道內容物百分比接近。空白組模型組18017016015014013012020017515012510075501612840-4大鼠24 h排便量(g)乳酸桿菌菌落數(n)大腸桿菌菌落數(n)100806040200雙歧桿菌菌落數(n)空白組模型組1 6 11 16 201 6 11 16 200 7 14 201 6 11 16 20

35、空白組模型組給藥后時間(d)給藥后時間(d)給藥后時間(d)給藥后時間(d)圖4 便秘對大鼠24 h糞便量及糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量的影響Figure 4 Effects of constipation on the 24-hour volume of defecation, contents of E. coli, bacillus coli and Lactobacillus in feces of rats圖注：圖中A為24 h糞便量，B-D分別為0.1 g糞便培養獲得的大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌菌落數。與空白組相比，aP < 0.05，bP < 0.01。圖

36、5 便秘對大鼠盲腸內容物的影響(革蘭氏染色，×1 000)Figure 5 Effect of constipation on the contents of the cecum in rats (Gram staining, x1 000)圖注：圖中A為空白組；B為模型組。在給藥20 d后，與空白組相比，模型組大鼠盲腸內革蘭陽性/陰性細菌數量降低，且桿菌/球菌比值下降。AB6050403020100ADCBbba空白組模型組M M MCBABA圖6 盲腸內容物細菌16S rDNA V3區聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳電泳結果Figure 6 PCR-denaturing grad

37、ient gel electrophoresis results of the V3 region of 16S rDNA gene in the cecum圖注：圖中A為細菌總DNA瓊脂糖凝膠電泳結果；B為細菌總DNA的16S V3區PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果；C為PCR擴增產物的梯度變性凝膠電泳結果。M：maker；：空白組；：模型組。圖7 便秘對大鼠結腸結構的影響(蘇木精-伊紅染色，×100)Figure 7 Effect of constipation on the structure of colon in rats (hematoxylin-eosin stain

38、ing, x100)圖注：圖中A為空白組；B為模型組。與空白組相比，模型組大鼠結腸隱窩深度變淺，結腸結構損傷嚴重。則是造模周期長，無死亡率。作者對便秘大鼠形成過程中常規基礎指標進行測定，結果顯示復方地芬諾酯給藥處理過程中，便秘大鼠體質量、體質量日變化量增加，十二指腸的腸道張力無顯著差異，回腸腸道張力收縮頻率明顯降低，腸道內容物百分比明顯增加，24 h糞便量減少，這些常規基礎實驗指標結果均符合便秘模型表現14，且造模過程中無大鼠死亡發生，因此作者采用10 mg/kg的復方地芬諾酯灌胃給藥復制便秘大鼠模型穩定、快速、無死亡率。便秘是現代臨床發病率非常高的胃腸道功能性疾病，現代研究表明，除始動發病因

39、素外，腸道菌群紊亂也與便秘的發生、發展有著密不可分的關聯。在人體腸道中定植約1×1014個微生物，生理狀態下這些細菌與機體胃腸道構成人類胃腸道微生態系統15，在成人腸道中細菌質量約1.5 kg，編碼約300萬個基因，是人類基因組編碼基因數的150多倍，亦被稱作是人體的“第二基因組”16。腸道菌群的轉化產物、代謝合成產物、細胞成分等對宿主的生理功能的正常發揮起著非常重要的作用，腸道菌群因此也被稱為“人體器官”17。根據腸道微生物對機體的作用，可以將腸道菌群分為三大類：生理性菌群，定植于深層黏膜上皮細胞表面，如類桿菌、雙歧桿菌等專性厭氧菌，屬于腸道菌群中的優勢菌群，能夠為宿主提供所需營養

40、，調節宿主免疫；條件致病菌，如腸球菌、腸桿菌等，以兼性需氧菌為主，屬于非優勢菌群，僅當機體處于某些特定條件下對宿主有害，具有致病性；病原菌；大多為變形桿菌、假單胞菌等過路菌，微生態平衡時，過路菌長期定植的機會少、繁殖數量少，不會致病，但當腸道內外環境劇烈改變時，可導致人體發病18。因此，同時作者針對便秘大鼠糞便中以大腸桿菌為代表的條件致病菌，以雙歧桿菌、乳酸桿菌為代表的益生菌的動態變化進行研究。在實驗前期(腹瀉期)，便秘大鼠的新鮮糞便大腸桿菌(革蘭陰性桿菌)、雙歧桿菌和乳酸桿菌明顯減少，說明在便秘發生前期，菌群結構就已經發生紊亂；在給藥20 d后，大腸桿菌和雙歧桿菌有增多趨勢，乳酸桿菌則是持續

41、顯著降低，說明便秘會加重腸道菌群結構的紊亂。實驗后期的大鼠盲腸內革蘭陽性/陰性細菌、桿球菌比例明顯降低等情況一致表明便秘大鼠腸道菌群結構發生嚴重的紊亂。這也與Zoppi等19采用傳統培養方法研究便秘的嬰兒腸道菌群結構，得出便秘兒童糞便中梭菌屬、雙歧桿菌屬較健康兒童顯著升高的結論相一致。聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳技術可以有效的隨著變性劑濃度以及核算分子空間結構的差異來精確的分離大小相同或相近的核酸片段，特別適宜于分析樣品中優勢菌屬的動態變化情況。作者采用聚合酶鏈式反 應-變性凝膠梯度電泳方法檢測盲腸內菌群16S rDNA的V3可變區變化情況，來全面的了解盲腸內優勢菌群的變化情況。16S r

42、DNA其分子內存在的可變區，可以顯示出細菌屬及屬以上水平的特異性，適用于確定細菌的種屬及親緣關系8。聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳結果顯示，便秘大鼠盲腸內細菌總量明顯減少，部分菌屬增多，同時又有某些種屬的菌群丟失或者是菌群豐度減少至檢測到的最低限度。但是Zhu等18運用新一代高通量焦磷酸測序法研究便秘兒童的糞便微生物組成，結果表明，與健康兒童相比，便秘兒童糞便中糞球菌屬、瘤胃球菌屬顯著增加，而普雷沃氏菌屬則顯著下降。這與聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳結果趨勢相同，推測實驗中條帶缺失的可能與普雷沃氏菌屬有關，而對于便秘大鼠條帶亮度增強的部位，推測與糞球菌屬、瘤胃球菌屬相關。另外，近端結腸病理

43、結果顯示，便秘大鼠結腸隱窩深度減小，有大量的炎癥反應，杯狀細胞丟失。有研究表明腸道隱窩可以保護腸道干細胞，保證受損腸道細胞20；而杯狀細胞分泌黏蛋白，構成黏液屏障，為宿主體內共生菌提供定植場所，防止致病微生物的定植，且分泌的粘液能夠潤滑腸道、促進食物排空。近端結腸中杯狀細胞大量丟失，與便秘的發生有著密切的關系。有研究表明益生菌可以增強潰瘍性結腸炎小鼠腸道上皮屏障功能并促進腸道生長，從而減輕結腸損傷的嚴重程度21，推測這應與糞便中乳酸桿菌顯著減少有著密切的關系。越來越多的現代研究以及臨床應用表明，腸道菌群參與諸疾病的發展。實驗灌胃給予的復方地芬諾酯通過影響大鼠腸道功能以及腸道菌群的變化，而導致便

44、秘；便秘則在后期加重了腸道功能的損傷以及菌群結構紊亂。該研究結果對于探究便秘與腸道菌群紊亂二者之間的作用機制提供了理論和實驗依據，也為指導臨床合理治療便秘提供了強有力的證據。作者貢獻：李寒冰進行實驗設計，實驗實施，資料收集為張顏語，李根林審校。利益沖突：所有作者共同認可文章內容不涉及相關利益沖突。倫理問題：實驗方案經河南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，批準號為：DWLL201402037。文章查重：文章出版前已經過CNKI反剽竊文獻檢測系統進行3次查重。文章外審：文章經國內小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始

45、圖片、數據(包括計算機數據庫)記錄及樣本已按照有關規定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協議。4 參考文獻 References1 謝培,周永學.大鼠功能性便秘模型建立方法的研究J.陜西中醫,2014,35(3):377-379.2 趙兵,唐學貴,吳至久,等.復方地芬諾酯建立便秘模型與AQP8的相關性研究J.中醫臨床研究,2015(18): 107-110.3 Jeffery IB, O'Toole PW, Öhman L, et al. An irritable bowel syndrome subtype defined

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