1、論著.6A型肺炎鏈球菌莢膜多糖水解物的制備及其結(jié)合物在小鼠體內(nèi)免疫原性研究羅樹(shù)權(quán)'，楊英英二張妊奇李獻(xiàn)林杜嬌'，胡浩'，劉佳二劉月萍李阿妮'，任珍蕓I,劉愛(ài)萍'，侯亞莉I,謝貴林21.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室甘謝省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州7300462.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京100029摘要：目的制備6A型肺炎鏈球菌英膜多糖（PS6A）水解物及其結(jié)合物，研究結(jié)合物在小圈體內(nèi)的免疫原性。方法在60Y水解溫度下,篩選出PS6A水解適宜的酷酸水解濃度和水解時(shí)間。通過(guò)水解物和原糖（PS6A）的核磁共振氫譜（'HNMR）和磷譜

2、（31PNMR）比較驗(yàn)證水解物結(jié)構(gòu)的正確性。以1-景基4二甲胺基毗喘四氟硼酸鹽（1-Cyano-4-（dimethylamino）pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP）活化水解物的羥基.并與破傷風(fēng)類毒素己二酸酰麟衍生物（rrAH）結(jié)合，制備結(jié)合物ps6a-itah；并檢測(cè)結(jié)合物的理化性質(zhì)。通過(guò)抑制elisa分析原糖、水解物和結(jié)合物的抗原性。將小鼠分為2組（PS6A組和PS6A-TTah組），分別免疫3劑次,用間接EUSA分析原糖和結(jié)合物在小鼠體內(nèi)的免疫原性。結(jié)果多糖經(jīng)0.2mol/L醋酸60T水解8h后,其相對(duì)分子質(zhì)量大小（、）由0.03升高為0.51,重均相對(duì)分子

3、質(zhì)由8.127x10,"mol降為1.175x10sg/molo核磁共振結(jié)果表明,各特征質(zhì)予的化學(xué)位移相比原糖未發(fā)生改變。結(jié)合物的游離多糖質(zhì)址分?jǐn)?shù)為4.55%,游離載體蛋白質(zhì)質(zhì)最分?jǐn)?shù)為1.08%。抑制EUSA結(jié)果顯示,水解物、結(jié)合物的抑制曲線與原糖基本吻合。PS6A-TTah組有劑次加強(qiáng)效應(yīng)（P分別為0.001、0.004和0.001）,其第13針免后IgG抗體水平均高于PS6A組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.001、0.002和0.001）o結(jié)論制備的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特異基團(tuán)，以此水解物制備的結(jié)合物在小鼠體內(nèi)具有良好的免疫應(yīng)答。關(guān)鍵詞：6A型肺炎球菌莢膜多

4、糖;水解物;結(jié)合物;免疫原性中圖分類號(hào)：378.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-5673（2017）06.0001-08DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.001Preparationofhydrolysateforserotype6ApneumococcalpolysaccharideandrelatedconjugateimmunogenicityinmiceLUOShu-quan,YANGYing-ying,ZHANGYu-qi,LIXian-lin,DUJiao,HUHao,LIUJia,LIUYue-ping,UA-ni,RENZhen-yun,LIUAi-p

5、ing,HOUYa-ii,XIEGui-lin.TheFirstResearchDepartmentinLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthortXIEGui-lin,E-mail:glxieAbstract:ObjectiveTopreparethehydrolysateandconjugatefortype6Apneumococcalca

6、psularpolysaccharideandtoinvestigatetheimmunogenicityofconjugateinrnice.MethodsChoosethebestconcentrationandtimeofacidichydrolysisinordertodegradethemoleculeoftype6Apneumococcalcapsularpolysaccharideat60幻.Thestructureofhydrolysatewasvalidatedbasedonthe1HNMR,31PNMRbycomparingthepolysaccharidewithhydr

7、olysate.Thehydroxylofhydrolysatewasactivatedby1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridiniumtetraHuoroborate(CDAP)andthenconjugatedwithTTAHinpreparationoftheconjugate.Thephysicalandchemicalcharacteristicsoftheconjugatewereanalyzed.TheantigenicityofPS6A,hydrolysate,andconjugatewasanalyzedaninhibitionELISA.Thete

8、stedmiceweredividedintwogroupsPS6Aand0.51,wasdegradedfrom8.127x10sg/molto1.175x10sg/mol.TheNMRresultsshowedthatconformationofhydrolysatedidnotchangecomparedtoPS6A.Thecontentforfreepolysaccharideandfreecarrierproteinfromtheconjugatewas4.55%and1.08%,respectively.Tlieantigenicityofhydrolysateandconjuga

9、temaintainedinsameincomparisonwithPS6AintheinhibitionELISAresults.Therewereboostresponsesinthreeconjugateinjections(P=0.001,0.004,0.001).IgGconcentrationofconjugategroupwashigherthanPS6Agroupforeachinjection(P=0.001,0.002,0.001).ConclusionThespecificnaturalgroupsofthepolysaccharidewereeffectivelymai

10、ntainedafterhydrolysis,onwhichthepreparedconjugatedevelopedhighlyimmuneresponsesinmice.基金項(xiàng)目：甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃（1602FKDA008）作者簡(jiǎn)介:羅樹(shù)權(quán)（1982-）,男，助理研究員，主要從事細(xì)菌性疫苗的研發(fā)。通值作者:謝貴林,研究員，E-mail：glxie,conjugate,andimmunogenicityinmicewasanalyzedbyanindirectEUSAafterthreeinjections,respectively.ResultsThemoleculeoftype6Ap

11、neumococcalcapsularpolysaccharidewaseffectivelydegradedafterhydrolysedby0.2mol/Laceticacidat60X.for8hours,Thevaluewasdegradedfrom0.03toKeywords:Serotype6Apneumococcalcapsularpolysaccharide;Hydrolysate;Conjugate;Immunogenicity肺炎鏈球ftsl(Streptococcuspneumoniae)簡(jiǎn)稱肺炎球曲(Pneumococcus),以人類為主要宿主，引起肺炎、腦膜炎、中耳炎

12、、敗血癥等侵襲性疾病。根據(jù)其莢膜多糖結(jié)構(gòu)的差異，可分為94個(gè)血清型，其中30個(gè)血清型的菌株對(duì)人類致病，而6型(主要是6A和6B型)是重要的致病菌群。23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的應(yīng)用能有效保護(hù)2歲以上(含2歲)兒童及成人免受侵襲性肺炎球曲的感染，但不適用于2歲以下嬰幼兒，而該年齡段是肺炎球菌感染的高危人群。這是因?yàn)榍v膜多糖抗原為T細(xì)胞非依賴性抗原，需與蛋白載體結(jié)合成為T細(xì)胞依賴性抗原才能對(duì)嬰幼兒提供免疫保護(hù)。6A和6B型莢膜多糖為同分異構(gòu)體，具有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性,但并非所有抗6B型抗體都具有功能性交又反應(yīng)。2000年上市的7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevenar®包含血清型4、6B、9V、14

13、、18C、19F、23F,大大降低了侵襲性肺炎的發(fā)病率，但并未明顯降低6A型引起的侵襲性肺炎的發(fā)病率51o6B型肺炎球菌多糖及結(jié)合疫苗的調(diào)理吞噬結(jié)果顯示,6B型多糖抗原誘導(dǎo)的IgG抗體對(duì)6A抗原反應(yīng)很弱a”。同時(shí),6A型菌株具有較高的抗生素耐藥性*刃。因此，研發(fā)含有6A型肺炎球菌莢膜多糖(type6Apneumococcalcapsularpolysaccharide,以下簡(jiǎn)稱PS6A)的疫苗對(duì)于肺炎球菌疾病的預(yù)防具有重要的意義。2010年上市的13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevenar13®新增包括6A型在內(nèi)的其他6種血清型。如圖1所示,PS6A由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和。-核糖醇的四

14、糖重復(fù)單位構(gòu)成。其中，鼠李糖與核糖醇的C3位置連接,O-核糖醇?xì)埢腃5位置上含有磷酸二酯鍵停)。圖1PA6S基本重復(fù)單位化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1BasicrepeatingunitstructureofPA6S天然的PS6A相對(duì)分子質(zhì)量較大，其結(jié)合反應(yīng)難于控制,且結(jié)合物易交聯(lián)過(guò)大,不利于后續(xù)的分離純化。利用過(guò)氧化氫能將多糖降解，但在降解過(guò)程中也發(fā)生了末端基團(tuán)的富化，且由于過(guò)氧化氫性質(zhì)活潑，導(dǎo)致水解物批間質(zhì)量一致性不甚理想。研究中選擇在較溫和的溫度(60P)和較低的酸濃度F水解，盡量減少水解過(guò)程對(duì)多糖重要基團(tuán)和抗原表位的破壞,通過(guò)延長(zhǎng)水解時(shí)間達(dá)到水解多糖的目的。同時(shí)，將降解多糖與破傷風(fēng)類毒素(te

15、tanustoxoid,TT)和己二酸二酰®f(adipicaciddihydrazide,ADH)的衍生物(T1h)結(jié)合,結(jié)合物免疫小鼠后評(píng)估結(jié)合物誘導(dǎo)特異性IgG抗體水平。1材料與方法1.1多糖、蛋白、超免血清PS6A、TT、6A型肺炎球菌家兔免疫血清、精制破傷風(fēng)抗毒素血清,均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司制備。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH雌性小鼠，體質(zhì)量：1214&SPF級(jí)，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。1.3主要試劑及儀器堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗-鼠、羊抗-兔IgG,均購(gòu)自美國(guó)Southembiotech公司;ELISA和抑制ELISA包被用多糖、血清吸收用C多

16、糖，均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；ADH、3.二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC-HC1)J-氤基-4-二甲胺基毗嚏四氟硼酸鹽(CDAP)、三乙胺(TEA)、2,4,6.三硝基苯磺酸(TNBS)、乙臘、脫氧膽酸鈉(DOC)、意:酮，均購(gòu)自Sigma公司；冰醋酸、NaCl.NaOH.HCl,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。超濾器、超濾膜和透析袋，均購(gòu)自Millipore公司；凝膠層析系統(tǒng)購(gòu)自GE公司；高壓液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)Waters公司:DAWNHELEOS-口十八角激光散射儀.OptilabT-rEX示差檢測(cè)器，均購(gòu)自美國(guó)Wy-att公司；SepharoseCL-4B層析柱購(gòu)自GE

17、公司；TSKG層析柱及其保護(hù)柱，均購(gòu)自日本TOSOH公司;600MHz核磁共振譜儀購(gòu)自布魯克公司；SpectraMAX190酶標(biāo)儀、96孔酶標(biāo)板，均購(gòu)自Costar公司。1.4多糖水解物的制備及檢測(cè)1.4.1水解條件的篩選PS6A反應(yīng)終質(zhì)量濃度為5mg/mL,在60弋水浴條件下，分別以醋酸終濃度0.1mol/L水解1.5,2.5h,醋酸終濃度0.2mol/L水解2、4、8h0水解物中和pH后，經(jīng)SepharoseCL-4B層析柱層析，測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量大小分布，并與水解前多糖分布比較。篩選標(biāo)準(zhǔn):水解物的相對(duì)分子質(zhì)量大小應(yīng)介于0.450.55之間，其洗脫峰峰形應(yīng)為左右對(duì)稱的正態(tài)分布。1.4.2多

18、糖水解物的制備用1.4.1項(xiàng)選定的條件制備PS6A水解物(PS6A-hydrolysate,簡(jiǎn)稱水解物)，比較多糖水解前后相對(duì)分子質(zhì)量大小(谿)及重均相對(duì)分子質(zhì)a(Mw)o1.4.3核磁共振分析通過(guò)NMK)和磷譜(叩NMR)分析水解物與原糖(PS6A)的結(jié)構(gòu)。1.5結(jié)合物的制備1.5.1破傷風(fēng)類毒素衍生物的制備采用EDAC縮合法，將TT用0.85%NaCl溶液稀釋至終質(zhì)量濃度為10mg/mL,然后將其加入等體積的0.9mol/LADH(溶于0.85%、aCl溶液)中，調(diào)節(jié)至pH6.5,加入EDAC使其終濃度為7.5mmoi/L,控制pH在6.5±0.1,反應(yīng)2h,調(diào)節(jié)至pH8.0,終

19、止反應(yīng)，用含0.85%NaCl溶液5000mL超濾至500mL,重復(fù)6次收集濃縮液，除菌過(guò)濾。1.5.2結(jié)合物的制備用0.85%NaCl溶液溶解PS6A水解物至10mg/mL,室溫靜置過(guò)夜.測(cè)初始pH并將其調(diào)至5.86.0之間。將CDAP以200mg/mL濃度溶于乙臘中，加入多糖降解物一半質(zhì)量:的CDAP,維持pH5.86.0反應(yīng)30so用TEA溶液(28|iLTEA+972jjlLWF1)將pH維持在7.3±0.5反應(yīng)2min。按投入糖蛋白質(zhì)量比為1:1加入TTah，維持PH8.0±0.2之間反應(yīng)2ho反應(yīng)結(jié)束后，將pH調(diào)至7.0,將反應(yīng)物裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000

20、的透析袋中，以0.85%NaCl溶液為透析外液，透析2d,間隔12h置換透析液一次，此結(jié)合物稱為PS6A-TTaho結(jié)合物透析后用Sepharose4FastFlow層析柱純化，收集KdWO.2的洗脫液，流動(dòng)相為0.85%NaCl溶液。將收集的洗脫液以0.22膜除菌過(guò)濾,收集濾過(guò)液。1.6結(jié)合物的理化，性質(zhì)檢測(cè)1.6.1結(jié)合物多糖及蛋白質(zhì)含最多糖含量:采用慝酮硫酸法測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用Lowry法測(cè)定。1.6.2游離多糖及游離蛋白質(zhì)含量取結(jié)合物原液1mL,加入0.1mL1%脫氧膽酸鈉(Sodiumdeoxycholate,DOC)溶液混勻后28乞放置30min,再加入501mol/L鹽酸混勻后

21、于4X.20(XX)xg離心30min,取1mL上清液,測(cè)定上清液中多糖含雖,換算游離多糖含量。游離蛋白質(zhì)含量用高壓液相TSK-G3000S排阻層析測(cè)定，該層析柱能有效分離相對(duì)分子質(zhì)是W500000的物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量500000的大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，洗脫體積等于外水體積；而載體蛋白質(zhì)TV因其相對(duì)分子質(zhì)量為150()00左右，可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)結(jié)合物分子與載體蛋白質(zhì)的有效分離。流動(dòng)相為10mmol/L和pH7.2的磷酸鹽緩沖液,進(jìn)樣量0.1mL,流速0.5mL/mino1.6.3分子大小運(yùn)用SepharoseCL-4B凝膠過(guò)濾層析法對(duì)PS6A、多糖水解物、結(jié)合物的匕進(jìn)行檢測(cè)。使

22、用高效液相分子尺寸排阻層析-十八角激光散射儀(HPSEC-MALIS)聯(lián)用法測(cè)定PS6A、水解物、結(jié)合物的似將高效液相色譜分離的樣品流中的分子進(jìn)行多個(gè)角度的激光照射，得到信號(hào)后經(jīng)軟件測(cè)算得到財(cái)“°PS6A采用TSKG5000PWXL層析柱，水解物采用TSKG4000PW.層析柱，結(jié)合物M*分析使用TSKG6000PWxl層析柱。流動(dòng)相為10mmol/L和pH7.2的磷酸鹽緩沖液，進(jìn)樣量0.1mL,流速0.5mL/mino1.7鑒別試驗(yàn)使用瓊脂糖免疫雙擴(kuò)散法對(duì)結(jié)合物進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，方法參照中華人民共和國(guó)藥典2015版（三部）“免疫雙擴(kuò)散法”執(zhí)行。1.8抗原性的檢測(cè)用抑制ELISA檢測(cè)PS

23、6A、水解物、結(jié)合物的抗原性。以110pig/mLPS6A包被酶標(biāo)板，每孔加入100于37乞放置5h后洗板5次，每孔加入200皿封閉液,37T放置2hc將不同濃度的待測(cè)樣品溶液（PS6A或水解物，或結(jié)合物）60riL加入60J1L稀釋后的超免血清中，每個(gè)樣品濃度重復(fù)兩孔，充分混合形成抗原-抗血清混合液，室溫放置30min后，將此混合液100jiL加入酶標(biāo)板,37Y放置2h,洗板5次。每孔加入100piL堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗-兔lgG,37T放置1h,洗板5次。每孔加入100jiL堿性磷酸酶底物，避光放置2ho每孔加入50mL3mol/LNaOH終止反應(yīng)，讀取人妣心值。以未吸附的超免血清為陽(yáng)性對(duì)照

24、，未加血清的血清稀釋液為陰性對(duì)照，吸附的血清為樣品，陽(yáng)性孔的4明煩值應(yīng)在1-5-2.0之間，按如下公式計(jì)算抑制率：抑制率=“-y§X100%V405nm-405nmZ將多糖濃度和相應(yīng)濃度下的抑制率輸入Graph-Padprism軟件，繪制抑制曲線。比較各樣品EC50,EC50（50%Effectiveinhibitionconcentration）表示的是抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度。1.9結(jié)合物免疫原性的研究1.9.1分組及免疫將小鼠隨機(jī)分為2組（PS6A組和PS6A-TTah組），每組30只。經(jīng)腹股溝皮下注射，免疫劑量為0.2口g/只，每隔2周免疫1次，共免疫3次。分別于每次免

25、疫后2周小鼠眼球采血，分離血清（計(jì)為第1針、第2針、第3針）。1.9.2抗PS6AIgG含量的檢測(cè)用間接EL1SA測(cè)定血清抗PS6AIgG含量。將PS6A以1.0pig/mL包被于酶標(biāo)板，每孔加入100|iL,37丁放置5h,洗板5次。向每孔中加入200皿血清后2倍比系列稀釋，陽(yáng)性血清起始稀釋倍數(shù)為800倍,待測(cè)血清稀釋后用塑料膜覆蓋密封酶標(biāo)板，放入濕盒,37°C放置2h,洗板5次.每孔加入100|iL堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗-鼠IgG,37°C放置2h,洗板5次。每孔加入100堿性磷酸酶底物，避光放置2h。每孔加入50jiL3mol/LNaOH終止反應(yīng)，讀取A蜘傾值。采用Sof

26、tmax軟件分析中提供的四參數(shù)擬合法分析數(shù)據(jù)，陽(yáng)性血清ELISA單位為800EU/mL,應(yīng)用分析模板計(jì)算各樣品的IgG含世。1.9.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，免疫原性的比較采用單因素方差分析法計(jì)算P值,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1多鏈水解物的制備().8注：A為PS6A；B為醋酸終濃度0.Imol/L水解1.5h；C為儲(chǔ)酸終濃度0.Imol/L水解2.5h；D為艄酸終濃度0.2mol/L水解2h；E為船酸終濃度0.2mol/L水解4h；F為酪酸終濃度0.2mcl/L水解8h圖26A型肺炎球菌多糖水解前后SepharoseCL-4B層析圖Fi

27、g.2R)fileoftype6Apneumococcalpolysaccharideandthehydrolyzedpolysaccharidel)ySepharoseCL-4Behromatugraphy2.1.1水解條件的篩選及制備如圖2所示水解前多糖的K。為0.03,其為8.I27xlO5g/mol,分布范圍為3.650x10513.800x1（）5"mol。選擇醋酸終濃度0.2mol/L60丁水解8h的水解物分布曲線呈正態(tài)分布為0.51,其吃為1.175xlO5g/mol,分布范圍為0.240x1()53.777x105g/mol,所以選擇此條件制備水解物。2.1.2核磁共

28、振分析如圖3A所示,5.62ppm(1ppm=0.001%。)為半乳糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移,5.13ppm為葡萄糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移,5.05ppm為鼠李糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移,1.32ppm為鼠李糖甲基上質(zhì)子的化學(xué)位移。圖3B所示，以上3種質(zhì)子的化學(xué)位移與原糖(圖3A)完全一致。圖3C所7K,0.86ppm的峰吸收值最高，其峰為PS6A的磷峰，同時(shí)還有3個(gè)小雜峰可見(jiàn)，化學(xué)位移分別為1.89ppm,0.30ppm和-0.19ppm,為C多糖峰。水解物的磷譜圖(圖3D)和原糖的磷譜圖(圖3C)完全相同。DUUUuluBillfl.|116543210-1-2-3-46543210-1-2-3-4pp

29、mppm注:圖A為PS6A'HNMR；圖B為PS6A水解物的*HNMR；圖C為PS6A的"pNMR；圖D為PS6A水解物的*PNMR。圖3PS6A及水解物的'HNMR?'PNMR圖潛Fig.31HNMRand31PNMRspectraofPS6Aandthehydrolysate2.2結(jié)合物的理化性質(zhì)如表1所列，游離多糖含量為4.55%，游離蛋白質(zhì)含量為1.08%,多糖蛋白比為0.82o如圖4所示，PS6A.PS6A水解物、PS6A-TTah總糖及游離多糖經(jīng)SepharoseCL-4B分離后的化學(xué)分布，表明制備的結(jié)合物純化收取灼為0.2之前的部分可與游離多糖有

30、效分離。表16A型肺炎球菌結(jié)合物理化檢測(cè)結(jié)果Tab.1Physicalandchemicaldeterminationoftype6Apneumococcalcapsularpolysaccharide-proteinconjugate結(jié)合物多糖質(zhì)蟲(chóng)濃度(岫ml.)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(jig/mL)游離多糖(%)游離蛋白質(zhì)(%)虬(g/rnol)虬分布范圍(g/mol)PS6A-TTah83.16101.454.551.088.558X1064.134xl06-1.535X107圖4PS6A、水解物、結(jié)合物過(guò)SepharoseCL-4B的化學(xué)分布Fig.4ElutionprofilesofPS6A

31、xPS6A-hydrolysate,PS6A-1T<HbySepharoseCI-4B2.3鑒別試臉如圖5所示，結(jié)合物同時(shí)能與PS6A免疫血清和1T免疫血清產(chǎn)生沉淀線，且兩條沉淀線發(fā)生融合，說(shuō)明多糖經(jīng)水解再與蛋白載體結(jié)合后抗原性并未發(fā)生改變，多糖蛋白成功結(jié)合為結(jié)合物分子。4注：號(hào)烏斯必藍(lán)染色孔I是6A塑肺炎球侑站合物原液:孔2-6A壁肺炎球俏超免清;孔3是檔制破傷晚抗母索血清；孔4陰性對(duì)照0.85%aCI溶液圖5結(jié)合物瓊脂斯免疫雙擴(kuò)散Fig.5Agaros<*doubh*lininutxMliffusionofs<*n)ty|w6ApiiruiiKM-iwc-iil<*

32、apsularixilysacc'haridtpnihMnconjugah*2.4抗原性如圖6所示,PS6A、水解物、結(jié)合物的抑制曲線均呈典型S形曲線。從PS6A、水解物及結(jié)合物的EC50及M對(duì)數(shù)值可以看出，水解物和結(jié)合物用抑制ELISA所測(cè)得抑制曲線均與多糖抑制曲線基本吻合。如表2所列，PS6A、水解物、結(jié)合物的EC50差異均不高于|倍，旦均可達(dá)到100%抑制說(shuō)明多糖經(jīng)水解和結(jié)合后抗原性沒(méi)仃發(fā)生改變Igl多糖濃度(p.g/mL)|圖6PS6A.水解物及結(jié)合物的抑制曲線Fig.6Inhibition<unrofPS6X.|M>ksaclihari<lehy<ln

33、>lysal<*andvonjiig.ih*表2PS6A.水解物及結(jié)合物的EC50及.對(duì)數(shù)伉Tab.2EC50andlogarithmvalueofPS6A.|M)lysa(-hhari(lfhydrolysiilcandconjugate樣品E(3()(jig/mlJlgEC50(pig/ml.)PS6A0.3619-0.4414PS6A-hy<ln)lysatr0.27()7-0.5675PS6A-Trui0.2016-0.69552.5免疫原性如表3所列,PS6A組3針免疫無(wú)劑次加強(qiáng)效應(yīng)；PS6A-TTaii組3針之間有明顯劑次加強(qiáng)效應(yīng)（P分別為0.001.0.004和

34、0.001）,免疫后組內(nèi)3針間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F<0.05）。PS6A-TTah組與PS6A組第13針免后IgG抗體水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.001.0.002和0.001）。表明與PS6A組相比，PS6A-TTah組能夠誘導(dǎo)更高水平的PS6A抗體。表3PS6A與結(jié)合物免疫小鼠后誘導(dǎo)的血清抗PS6AIgG含量Tab.3Thecontentofanti-PS6AIgGinmiceserunisinducedbyPS6Aandconjugateinjections針次抗PS6AIgG含量PS6A組PS6A-TTah組第1針0.2(0.10.3)3.86(3.0-5.0)第

35、2針0.5(0.31.4)40.81(15.0-107.0)第3針0.4(0.51.7)462.79(119.01792.0)注：（）內(nèi)為95%置信區(qū)間的上下限。3討論為了盡量減少水解過(guò)程對(duì)多糖抗原基團(tuán)的影響，研究中采用相對(duì)比較溫和的醋酸水解的方法制備PS6A水解物。選用溫度60因?yàn)檫^(guò)高的溫度除了可能改變多糖的抗原性外還不易控制，對(duì)后期規(guī)模進(jìn)一步放大有一定的阻礙。研究中選用的酸濃度也較低,分別為0.1mol/L和0.2mol/L,通過(guò)延長(zhǎng)酸水解反應(yīng)的時(shí)間來(lái)達(dá)到水解的目的。結(jié)果顯O）-P-Cho示,終濃度0.2mol/L醋酸60Y水解8h的降解條件可以得到合格的水解物，而旦磷酸二酯鍵在此過(guò)程中未

36、受影響，得以完全保留。'HNMR（600MHz）是根據(jù)多糖上氫核在一定磁感應(yīng)強(qiáng)度下吸收了頻率適當(dāng)?shù)哪芰慷l(fā)生躍遷形成核磁共振現(xiàn)象，在儀器中便可記錄下其吸收的圖譜。氫根據(jù)其在多糖分子中所處的化學(xué)環(huán)境不同，發(fā)生共振吸收的頻率也稍有差異。在舊NMR圖譜中，峰的強(qiáng)度與氫核的數(shù)目成正比，由吸收峰的面積可以計(jì)算氫的相對(duì)比例或數(shù)目，因此該方法可以測(cè)定多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)種類和含量以及雜質(zhì)分子HNMR（600MHz）上的特征質(zhì)子的信號(hào)反映了不同型多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)上的氫的化學(xué)位移和數(shù)量，故根據(jù)這些特征性質(zhì)子位移可以達(dá)到對(duì)肺炎球菌多糖型鑒別的目的。為了驗(yàn)證研究中制備的6A型水解物結(jié)構(gòu)的正確性,采用了舊NMRL

37、pNMR對(duì)原糖和水解物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。'HNMR結(jié)果顯示,PS6A*HNMR圖與其他文獻(xiàn)報(bào)道的PS6A*HNMR結(jié)果完全相同m-E,PS6A與其水解物的舊NMR結(jié)果完全相同。3】PNMR結(jié)果顯示,其峰為PS6A的磷峰，同時(shí)還可見(jiàn)3個(gè)小雜峰。眾所周知，在肺炎球菌多糖的提取及純化過(guò)程中C多糖的存在是一個(gè)不可忽略的問(wèn)題,C多糖具有12個(gè)磷脂酰膽堿,1個(gè)磷酸重復(fù)單位的五糖g,結(jié)構(gòu)如圖7所示，具體表現(xiàn)為該圖譜的3個(gè)小峰:化學(xué)位移分別為1.89ppm、0.30ppm和-0.19ppm,與文獻(xiàn)15報(bào)道的PS6A31PNMR結(jié)果相一致。6A水解物的磷譜和原糖的磷譜完全相同，結(jié)合相應(yīng)的氫譜，說(shuō)明在水解過(guò)

38、程中，并未引入新的官能團(tuán)，且未發(fā)生磷酸二酯鍵的斷裂。O）-P-Cho666)-3-Glcp-(1*3)-a-AATGp-(l*4)-a-GalpNAc-(l*3)-g-GalpNAc-(11)-ribitol-5-P-(O圖7肺炎球菌C多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7ChemicalstructureofpneumococcalCpolysaccharide相比直接使用原糖結(jié)合，由PS6A水解物制備的結(jié)合物更有利于與游離多糖間的分離純化，且結(jié)合物的分子大小更易控制。研究中同時(shí)采用Sepha-roseCL-4B和HPSEC-MALLS兩種方法測(cè)定水解物及結(jié)合物的分子大小，能夠更直觀、更精確的對(duì)水解物和結(jié)

39、合物的分子大小進(jìn)行分析。研究中將水解物通過(guò)CDAP活化,EDAC縮合與ttah結(jié)合，制備成結(jié)合物,通過(guò)結(jié)合物的免疫原性可進(jìn)一步評(píng)估水解物制備條件的正確性。通過(guò)抑制ELISA評(píng)價(jià)從原糖、水解物、結(jié)合物的抗原性變化，通過(guò)間接ELISA測(cè)定結(jié)合物免疫小鼠后IgG抗體水平評(píng)價(jià)結(jié)合物的免疫原性。從抑制ELISA結(jié)果看，多糖經(jīng)水解和結(jié)合等多個(gè)步驟,抗原性并無(wú)明顯差異，表明多糖上抗原表位未發(fā)生變化。間接ELISA顯示結(jié)合物免疫小鼠能夠誘導(dǎo)更高的抗PS6AIgG抗體水平，呈劑次加強(qiáng)，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了良好的免疫應(yīng)答。綜上所述，研究中成功制備了6A型肺炎球菌多糖水解物，水解條件較為溫和、易放大，且水解過(guò)程中無(wú)抗原

40、表位的破壞，能有效的保留天然多糖的特異基團(tuán)；以此水解物制備的結(jié)合物在小鼠體內(nèi)具有良好的免疫原性。為6A型肺炎球菌多糖水解物的制備及肺炎球菌結(jié)合疫苗的制備提供參考。參考文獻(xiàn)LUDWIGE,BONANNIP,ROHDEG,etal.Theremainingchallengesofpneumococcaldiseaseinadults(J.EurRespirRev,2012,21(123)：57-65.1 LYUS,HUHL,YANGYH.AsystematicreviewaboutStreptococcuspneumoniaeserotypedistributioninchildreninmain

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