1、復習專題基因工程基本操作程序 1獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫 中獲取目的基因和利用中獲取目的基因和利用PCR技術擴增目的基技術擴增目的基 因。因。 2基因表達載體的構建是實施基因工程的基因表達載體的構建是實施基因工程的 第二步，也是基因工程的核心。第二步，也是基因工程的核心。 3一個基因表達載體的組成，除了目的基因一個基因表達載體的組成，除了目的基因 外，還必須有啟動子、終止子以及標記基因等外，還必須有啟動子、終止子以及標記基因等 。4將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花 粉

2、管通道法。粉管通道法。5培育轉基因動物時，受體細胞一般是受精卵，目的基因的導入方培育轉基因動物時，受體細胞一般是受精卵，目的基因的導入方 法常用顯微注射技術。法常用顯微注射技術。6檢測目的基因是否導入和轉錄，常用分子雜交技術；檢測是否翻檢測目的基因是否導入和轉錄，常用分子雜交技術；檢測是否翻 譯，常用抗原譯，常用抗原抗體雜交技術。抗體雜交技術。自讀教材自讀教材夯基礎夯基礎 1目的基因目的基因 (1)主要是指主要是指 的基因。的基因。 (2)也可以是一些具有也可以是一些具有 的因子。的因子。 2獲取方法獲取方法 (1)從基因文庫中獲取：從基因文庫中獲取： 基因文庫的含義：將含有某種生物不同基因的

3、許基因文庫的含義：將含有某種生物不同基因的許多多 ，導入，導入 的群體中儲存，各個受體菌分別含的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。有這種生物的不同的基因。編碼蛋白質編碼蛋白質調控作用調控作用DNA片段片段受體菌受體菌(2)利用利用PCR技術擴增目的基因：技術擴增目的基因：原理：原理： 。前提條件：有一段已知目的基因的前提條件：有一段已知目的基因的 ，以便根據，以便根據這一序列合成這一序列合成 。條件：條件：DNA模板、模板、 、 和和4種脫氧核種脫氧核苷酸。苷酸。DNA復制復制核苷酸序列核苷酸序列引物引物熱穩定熱穩定DNA聚合酶聚合酶引物引物擴增過程：擴增過程：受熱受熱引物引

4、物熱穩定熱穩定DNA聚合酶聚合酶（3） 1探討基因文庫、基因組文庫、探討基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫之間的關系。文庫之間的關系。 提示：基因組文庫含有一種生物的全部基因，而提示：基因組文庫含有一種生物的全部基因，而cDNA文文庫只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫。庫只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫。 2從酶的角度分析從酶的角度分析PCR技術擴增技術擴增DNA與與DNA體內復制的體內復制的不同點。不同點。 提示：提示：PCR技術擴增技術擴增DNA不需要解旋酶；不需要解旋酶；PCR技術需技術需要的要的DNA聚合酶應具有熱穩定性。聚合酶應具有熱穩定性。跟隨名師跟隨名師解疑難解

5、疑難1提取目的基因方法的比較提取目的基因方法的比較方方法法基因文庫的構建基因文庫的構建PCR技術技術擴增擴增人工合成人工合成基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫(如如cDNA文庫文庫)過過程程供體細胞中的供體細胞中的DNA 限制酶限制酶許多許多DNA片段片段 連接連接表達載體表達載體 導入導入受體細胞受體細胞 外源外源DNA擴增，產生擴增，產生特定性狀特定性狀 分離分離目的基因目的基因目的基因的目的基因的mRNA 反轉錄反轉錄單鏈單鏈DNA 合成合成雙鏈雙鏈DNA 插入插入載體載體 導入導入受體菌群受體菌群(cDNA文庫文庫) 分離分離目的基因目的基因目的基因目的基因DNA 高溫高溫

6、解鏈解鏈單鏈單鏈DNA 與引與引 物結合物結合 、DNADNA 聚合聚合 酶酶大量目大量目的基因的基因蛋白質的氨蛋白質的氨基酸序列基酸序列 推測推測mRNA的核的核苷酸序列苷酸序列 推測推測基因的核基因的核苷酸序列苷酸序列 化學化學 合成合成目的基因目的基因方方法法基因文庫的構建基因文庫的構建PCR技術技術擴增擴增人工合成人工合成基因組文庫基因組文庫部分基因文部分基因文庫庫(如如cDNA文庫文庫)優優點點操作簡單操作簡單專一性強專一性強可在短時可在短時間內大量間內大量擴增目的擴增目的基因基因專一性強，專一性強，可產生自然可產生自然界中不存在界中不存在的新基因的新基因缺缺點點工作量大、工作量大、

7、盲目性大、盲目性大、專一性差專一性差操作過程較麻操作過程較麻煩，技術要求煩，技術要求過高過高需要嚴格需要嚴格控制溫度，控制溫度，技術要求技術要求高高適用范圍小適用范圍小2PCR技術與生物體內技術與生物體內DNA復制的比較復制的比較DNA復制復制PCR技術技術區區別別解旋解旋方式方式解旋酶催化解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋在高溫作用下變性解旋場所場所細胞內細胞內(主要在細胞核內主要在細胞核內)細胞外細胞外(主要在主要在PCR擴增儀內擴增儀內)酶酶DNA解旋酶、普通的解旋酶、普通的DNA聚合聚合酶等酶等耐熱的耐熱的DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)溫度溫度條件條件細胞內溫和條件細胞內溫

8、和條件需控制溫度，在較高溫度下進行需控制溫度，在較高溫度下進行合成合成的對的對象象DNA分子分子DNA片段或基因片段或基因聯系聯系模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成原料：均為四種脫氧核苷酸原料：均為四種脫氧核苷酸酶：均需要酶：均需要DNA聚合酶進行催化聚合酶進行催化引物：均需要引物，使引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的聚合酶從引物的3端開始連接脫氧端開始連接脫氧核苷酸核苷酸 特別提醒特別提醒 (1)基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動子才比較有利于基因的表達。動子才比較有利于基因的

9、表達。 (2)通過通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞中無法轉錄。編碼序列導入受體細胞中無法轉錄。 (3)熱穩定熱穩定DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)能在高溫下保持其能在高溫下保持其活性，是活性，是PCR技術關鍵的工具之一。技術關鍵的工具之一。自讀教材自讀教材夯基礎夯基礎 1基因表達載體的構建基因表達載體的構建 (1)目的：使目的基因在受體細胞中目的：使目的基因在受體細胞中 ，并且可以，并且可以遺傳和遺傳和 。 (2)組成：組成：穩定存在穩定存在表達表達 2將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞 (1)導入植物細胞的

10、方法：導入植物細胞的方法：TDNA雙子葉植物雙子葉植物裸子裸子 ：常用于單子葉植物。：常用于單子葉植物。花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。(2)導入動物細胞：導入動物細胞：方法：方法： 技術。技術。常用受體細胞：常用受體細胞： 。植物植物基因槍法基因槍法顯微注射顯微注射受精卵受精卵 (3)導入微生物細胞：導入微生物細胞： 原核生物特點：原核生物特點： 、多為、多為 、遺傳物質、遺傳物質相對相對 等。等。 方法：感受態細胞法，即用方法：感受態細胞法，即用 處理細胞，使細處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中胞處于一種能吸收周圍環

11、境中DNA分子的生理狀態分子的生理狀態(這種細這種細胞稱為胞稱為 )。繁殖快繁殖快單細胞單細胞Ca2較少較少感受態細胞感受態細胞 1思考基因表達載體的構建需要哪些工具酶。思考基因表達載體的構建需要哪些工具酶。 提示：限制酶、提示：限制酶、DNA連接酶。連接酶。 2結合教材結合教材P13資料卡分析，用花粉管通道法導入受體細資料卡分析，用花粉管通道法導入受體細胞的目的基因是否需要和載體結合？試分析原因。胞的目的基因是否需要和載體結合？試分析原因。 提示：需要。因為目的基因只有和載體結合成基因表達載提示：需要。因為目的基因只有和載體結合成基因表達載體才容易在受體細胞中穩定維持和表達。體才容易在受體細

12、胞中穩定維持和表達。 3為什么動物的體細胞不能作為受體細胞？為什么動物的體細胞不能作為受體細胞？ 提示：動物體細胞全能性受到限制，不能發育為一個新個提示：動物體細胞全能性受到限制，不能發育為一個新個體。體。跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1基因表達載體的構建過程基因表達載體的構建過程 將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成一個重組連接酶，形成一個重組DNA分子分子(重組質粒重組質粒)。構建過程如。構建過程如圖所示：圖所示：2將目的基因導入受體細胞的方法比較將目的基因導入受體細胞的方法比較受體受體細胞細胞植物細胞植物細胞動

13、物細胞動物細胞微生物細胞微生物細胞常用常用方法方法農桿菌轉化法、基因槍農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法法、花粉管通道法顯微注射技術顯微注射技術感受態細胞法感受態細胞法受體受體細胞細胞體細胞體細胞受精卵受精卵原核細胞原核細胞轉化轉化過程過程以農桿菌轉化法為例：以農桿菌轉化法為例：將目的基因插入將目的基因插入Ti質粒質粒的的TDNA上上轉入農桿菌中轉入農桿菌中導入植物細胞導入植物細胞整合到受體細胞的整合到受體細胞的DNA上上提純含目的基提純含目的基因的表達載體因的表達載體顯微注射顯微注射受精卵發育受精卵發育具有新性具有新性狀的個體狀的個體Ca2處理細胞處理細胞感受態細胞感受態細胞基因表達載體與

14、基因表達載體與感受態細胞混合感受態細胞混合感受態細胞感受態細胞吸收吸收DNA分子分子 特別提醒特別提醒 (1)完成基因表達載體的構建，需要限制性核酸內切酶和完成基因表達載體的構建，需要限制性核酸內切酶和DNA連接酶，連接產物有目的基因連接酶，連接產物有目的基因目的基因，目的基因目的基因，目的基因運運載體和運載體載體和運載體運載體三種。運載體三種。 (2)將基因表達載體將基因表達載體(重組質粒重組質粒)導入農桿菌的常用方法是導入農桿菌的常用方法是Ca2處理法。處理法。Ca2(或或CaCl2溶液溶液)對微生物細胞的作用是增加對微生物細胞的作用是增加細胞壁的通透性。細胞壁的通透性。自讀教材自讀教材夯

15、基礎夯基礎1分子水平的檢測分子水平的檢測(連線連線)2個體水平的鑒定個體水平的鑒定(1) 的接種實驗。的接種實驗。(2)對基因工程產品與天然產品的功能進行對基因工程產品與天然產品的功能進行 。抗蟲或抗病抗蟲或抗病活性比較活性比較 1檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？是什么？ 提示：用葉片飼養棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。提示：用葉片飼養棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。 2DNA分子雜交的原理是什么？有哪些應用？分子雜交的原理是什么？有哪些應用？ 提示：堿基互補配對原則。可用于親子鑒定、刑事偵查、提示：堿基互補配對原則。可用于親子鑒定、

16、刑事偵查、生物親緣關系確定等。生物親緣關系確定等。跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 目的基因的檢測與鑒定歸納目的基因的檢測與鑒定歸納 例例1為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因導入水稻，培育低植酸轉基因水稻品種。下圖是獲取植酸基因導入水稻，培育低植酸轉基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。酶基因的流程。 據圖回答：據圖回答： (1)圖中基因組文庫圖中基因組文庫_(填填“小于小于”“等于等于”或或“大于大于”)cDNA文庫。文庫。 (2)B過程需要的酶是過程需要的酶是_；A、C過程中過程中_(填填“可以可以”或或“不可以不可以”)使用同一種

17、探針篩選含目的基因的菌株。使用同一種探針篩選含目的基因的菌株。 (3)目的基因目的基因和和除可從構建的文庫中分離外，還可以分除可從構建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中別利用圖中_和和_為模板直接進行為模板直接進行PCR擴增，擴增，該過程中所用酶的顯著特點是該過程中所用酶的顯著特點是_。 思路點撥思路點撥 精講精析精講精析分析獲取植酸酶基因的流程圖可知，圖中分析獲取植酸酶基因的流程圖可知，圖中基因組文庫大于基因組文庫大于cDNA文庫。文庫。B過程需要的酶應該是逆轉錄酶；過程需要的酶應該是逆轉錄酶；A、C過程雖然都能獲得含目的基因的菌株，但過程雖然都能獲得含目的基因的菌株，但C中無內含子中無內含

18、子對應的序列，所以不可以使用同一種探針進行篩選。目的基對應的序列，所以不可以使用同一種探針進行篩選。目的基因因和和除可從構建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中除可從構建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中DNA和和cDNA為模板直接進行為模板直接進行PCR擴增，該過程中所用酶的擴增，該過程中所用酶的顯著特點是耐高溫。顯著特點是耐高溫。 答案答案(1)大于大于 (2)逆轉錄酶逆轉錄酶不可以不可以 (3)DNAcDNA耐高溫耐高溫 (2)表達：只有編碼區能轉錄生成表達：只有編碼區能轉錄生成RNA，且內含子轉錄的，且內含子轉錄的部分要剪切掉，即轉錄生成的部分要剪切掉，即轉錄生成的mRNA只有外顯子對應

19、部分。因只有外顯子對應部分。因此，以此，以mRNA為模板，逆轉錄產生的目的基因中沒有內含子、為模板，逆轉錄產生的目的基因中沒有內含子、啟動子和終止子。啟動子和終止子。下列關于下列關于cDNA文庫和基因組文庫的說法中，不正確的是文庫和基因組文庫的說法中，不正確的是()AcDNA文庫中的文庫中的DNA來源于來源于mRNA的反轉錄過程的反轉錄過程B如果某種生物的如果某種生物的cDNA文庫中的某個基因與該生物的基因組文庫中的某個基因與該生物的基因組 文庫中的某個基因控制的性狀相同，則這兩個基因的結構文庫中的某個基因控制的性狀相同，則這兩個基因的結構 也完全相同也完全相同CcDNA文庫中的基因都沒有啟動

20、子文庫中的基因都沒有啟動子D一種生物的一種生物的cDNA文庫可以有許多種，但基因組文庫只有一文庫可以有許多種，但基因組文庫只有一 種種解析：由于基因轉錄時只有編碼區段才能轉錄，所以以解析：由于基因轉錄時只有編碼區段才能轉錄，所以以mRNA反反轉錄成的轉錄成的DNA就只有外顯子區段，而缺少內含子和啟動子等非編就只有外顯子區段，而缺少內含子和啟動子等非編碼區段，和原來的基因結構不相同。碼區段，和原來的基因結構不相同。答案：答案：B. . 例例2右圖為某種質粒表達載體簡圖，右圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內切酶小箭頭所指分別為限制性核酸內切酶EcoR、BamH的酶切位點，的酶切

21、位點，ampr為青霉素抗性基為青霉素抗性基因，因，tetr為四環素抗性基因，為四環素抗性基因，P為啟動子，為啟動子，T為為終止子，終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoR、BamH在內的多種酶的酶切位點。在內的多種酶的酶切位點。 據圖回答：據圖回答： (1)將含有目的基因的將含有目的基因的DNA與質粒分別用與質粒分別用EcoR酶切，酶酶切，酶切產物用切產物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連片段之間連接形成的產物有接形成的產物有_、_、_三種。三種。 (2)用上述用上述3種連接產物與無任何

22、抗藥性的原核宿主細胞進種連接產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環素的培養基中，行轉化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物有能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物有_；若接種到含青霉素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有若接種到含青霉素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物有的連接產物有_。 (3)目的基因表達時，目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是聚合酶識別和結合的位點是_，其合成的產物是，其合成的產物是_。 (4)在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒在酶切后產生在上述實驗中，為了防止

23、目的基因和質粒在酶切后產生的末端發生任意連接，酶切時應選用的酶是的末端發生任意連接，酶切時應選用的酶是_。思路點撥思路點撥 精講精析精講精析(1)將含有目的基因的將含有目的基因的DNA與質粒分別用與質粒分別用EcoR酶切，所產生的黏性末端相同，用酶切，所產生的黏性末端相同，用DNA連接酶處理后，連接酶處理后，不同的片段隨機結合，可形成不同的片段隨機結合，可形成3種不同的連接物：目的基因種不同的連接物：目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因運載體、運載體運載體、運載體運載體。運載體。 (2)在上述三種產物中，插入目的基因的都不能在四環素在上述三種產物中，插入目的基因的都不能在四環素培養基上

24、生長，只有運載體培養基上生長，只有運載體運載體連接產物才能在含四環運載體連接產物才能在含四環素的培養基上生長。素的培養基上生長。 (3)啟動子是啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點，可啟動轉錄聚合酶識別和結合的位點，可啟動轉錄過程，合成過程，合成mRNA。 (4)由圖示和題目中提供的信息可知，同時運用由圖示和題目中提供的信息可知，同時運用EcoR和和BamH進行酶切可有效防止酶切后產生的末端發生任意進行酶切可有效防止酶切后產生的末端發生任意連連接。接。 答案答案(1)目的基因目的基因載體連接物載體連接物載體載體載體連接物載體連接物目的基因目的基因目的基因連接物目的基因連接物 (2)載體載體載體

25、連接物載體連接物目的基因目的基因載體連接物、載載體連接物、載體體載體連接物載體連接物 (3)啟動子啟動子mRNA (4)EcoR和和BamH (1)切割目的基因和運載體時并非只能用一種酶，但無論用切割目的基因和運載體時并非只能用一種酶，但無論用幾種酶，一般都用相同種類的酶切割目的基因和運載體。幾種酶，一般都用相同種類的酶切割目的基因和運載體。 (2)啟動子啟動子起始密碼，終止子起始密碼，終止子終止密碼。終止密碼。啟動子和終止子位于基因結構的非編碼區，起始密碼和終止密啟動子和終止子位于基因結構的非編碼區，起始密碼和終止密碼位于碼位于mRNA上。上。 例例3農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下面是農桿菌轉化法的示意圖，試回答下列問題：面是農桿菌轉化法的示意圖，試回答下列問題： (1)一般情況下農桿菌不能感染的植物是一般情況下農桿菌不能感染的植物是_，利用農，利用農桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現_。具體原理是在農桿。具體原理是在農桿菌的