1、.醛糖復(fù)原酶基因AR的克隆一、醛糖復(fù)原酶DNA模板的構(gòu)建抽取人體血液，經(jīng)過(guò)親和色譜法提取mRNA，該過(guò)程可用商業(yè)化的試劑盒別離系統(tǒng)，得到高純度mRNA。再用RT-PCR法，逆轉(zhuǎn)錄出c-DNA,再合成AR基因。二、引物設(shè)計(jì)登陸NCBI，進(jìn)入“核酸中，輸入醛糖復(fù)原酶的登陸碼：U37100，找到該序列：1 CAAAAACAGC AACAGAAAGC AGGACGTGAG ACTTCTACCT GCTCACTCAG AATCATTTCT61 GCACCAACCA TGGCCACGTT TGTGGAGCTC AGTACCAAAG CCAAGATGCC CATTGTGGGC121 CTGGGCACTT G

2、GAAGTCTCC TCTCGGCAAA GTGAAAGAAG CAGTGAAGGT GGCCATTGAT181 GCAGGATATC GGCACATTGA CTGTGCCTAT GTCTATCAGA ATGAACATGA AGTGGGGGAA241 GCCATCCAAG AGAAGATCCA AGAGAAGGCT GTGAAGCGGG AGGACCTGTT CATCGTCAGC301 AAGTTGTGGC CCACTTTCTT TGAGAGACCC CTTGTGAGGA AAGCCTTTGA GAAGACCCTC361 AAGGACCTGA AGCTGAGCTA TCTGGACGTC TAT

3、CTTATTC ACTGGCCACA GGGATTCAAG421 TCTGGGGATG ACCTTTTCCC CAAAGATGAT AAAGGTAATG CCATCGGTGG AAAAGCAACG481 TTCTTGGATG CCTGGGAGGC CATGGAGGAG CTGGTGGATG AGGGGCTGGT GAAAGCCCTT541 GGGGTCTCCA ATTTCAGCCA CTTCCAGATC GAGAAGCTCT TGAACAAACC TGGACTGAAA601 TATAAACCAG TGACTAACCA GGTTGAGTGT CACCCATACC TCACGCAGGA GAAAC

4、TGATC661 CAGTACTGCC ACTCCAAGGG CATCACCGTT ACGGCCTACA GCCCCCTGGG CTCTCCGGAT721 AGACCTTGGG CCAAGCCAGA AGACCCTTCC CTGCTGGAGG ATCCCAAGAT TAAGGAGATT781 GCTGCAAAGC ACAAAAAAAC CGCAGCCCAG GTTCTGATCC GTTTCCATAT CCAGAGGAAT841 GTGATTGTCA TCCCCAAGTC TGTGACACCA GCACGCATTG TTGAGAACAT TCAGGTCTTT901 GACTTTAAAT TGAG

5、TGATGA GGAGATGGCA ACCATACTCA GCTTCAACAG AAACTGGAGG961 GCCTGTAACG TGTTGCAATC CTCTCATTTG GAAGACTATC CCTTCGATGC AGAATATTGA1021 GGTTGAATCT CCTGGTGAGA TTATACAGGA GATTCTCTTT CTTCGCTGAA GTGTGACTAC1081 CTCCACTCAT GTCCCATTTT AGCCAAGCTT ATTTAAGATC ACAGTGAACT TAGTCCTGTT1141 ATAGACGAGA ATCGAGGTGC TGTTTTAGAC ATT

6、TATTTCT GTATGTTCAA CTAGGATCAG1201 AATATCACAG AAAAGCATGG CTTGAATAAG GAAATGACAA TTTTTTCCAC TTATCTGATC1261 AGAACAAATG TTTATTAAGC ATCAGAAACT CTGCCAACAC TGAGGATGTA AAGATCAATA1321 AAAAAAATAA TAATCAT該段序列在70-1020bp可以合成蛋白質(zhì)1、將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入到軟件中Primer Premier2、根據(jù)起始密碼子AUG和終止密碼子(UAG、UGA、UAA)，點(diǎn)擊“Find分別找出各位置：ATG：70、106、50

7、2、925TAG：1115TGA：1018TAA：1114選擇起始密碼為502，終止密碼為1018.輸入軟件300bp到900bp選擇如下片段5 TCGGCAAAGTGAAAGAAG 33 CTGATAGGGAAGCTACGT 5根據(jù)所選序列1431011選擇酶切位點(diǎn)在1431011序列含有的酶切位點(diǎn)有在目的序列外的限制性內(nèi)切酶有選擇EcoR 和Xba 作為雙酶切限制性內(nèi)切酶，EcoRIGAATTCXbaITCTAGA那么上游引物序列：5 ATATGAATTCGAT-TCGGCAAAGTGAAAGAAG 3下游引物序列：5TGCTCTAGAT-TGCATCGAAGGGATAGTC 3三、PCR

8、擴(kuò)增1、為了減少非靶序列的擴(kuò)增，采用嵌套構(gòu)造：即利用第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的起始材料。2、反響的dNTP的濃度要一致。3、反響的條件有：模板、引物、原料dNTP、耐熱的DNA聚合酶Taq酶、Mg離子濃度、反響緩沖液BSA、PCR促進(jìn)劑等。4、用瓊脂糖凝膠電泳提純擴(kuò)增的DNA，在紫外燈下用刀片將目的區(qū)段切下來(lái)，放入DNA提取試劑盒中提純。變性：溫度為94攝氏度，時(shí)間為30秒退火：溫度為52.9攝氏度延伸：溫度為72攝氏度，時(shí)間為30秒循環(huán)次數(shù)：30次四、載體的選擇選擇Pcmv-n-His質(zhì)粒pCMV-N-His是碧云天自行研發(fā)的用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)N端和His tag (H

9、is標(biāo)簽)融合的目的蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。含有CMV啟動(dòng)子可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)；在多克隆位點(diǎn)的5端含有一個(gè)可以編碼His標(biāo)簽的序列，因此可以表達(dá)出含有His標(biāo)簽的融合蛋白，可以方便地使用抗His的抗體來(lái)識(shí)別目的蛋白，有利于目的蛋白檢測(cè)和別離純化。質(zhì)粒為卡那霉素抗性。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。pCMV-N-His質(zhì)粒中對(duì)于插入片斷進(jìn)展測(cè)序時(shí)，推薦使用的正向測(cè)序引物T3和反向測(cè)序引物T7的序列如下：    T3 primer(620639): 5AATTAACCCTCACTAAAGGG 3  

10、0; T7 primer(815-836): 5GTAATACGACTCACTATAGGGC 3   五、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、用限制性內(nèi)切酶EcoR1、Xbal酶切Pcmv-n-His和AR基因。12 h后于75高溫10 min滅活兩種酶。反響條件由提供內(nèi)切酶的公司提供2、用瓊脂糖凝膠電泳法純化酶切后的AR基因片段和Pcmv-n-His載體,再用DNA回收試劑盒回收。3、酶切后的AR基因及載體DNA濃度用分光光度法260nm測(cè)定，目的基因/載體基因 為 6/1或更高，加T4 DNA連接酶，于16連接過(guò)夜,構(gòu)建成重組質(zhì)粒。4、轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密