1、促凋亡基因bad在皮膚血管瘤組織中的表達         【關鍵詞】  bad；,血管瘤；,凋亡；,免疫組織化學,    摘  要：  目的：探討促凋亡基因bad在皮膚血管瘤中的表達及其與臨床的關系。方法：采用免疫組織化學方法檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組            【關鍵詞】; bad；,血管瘤；,凋亡

2、；,免疫組織化學, 摘; 要：; 目的：探討促凋亡基因bad在皮膚血管瘤中的表達及其與臨床的關系。方法：采用免疫組織化學方法檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織中bad的表達水平，利用計算機圖像分析技術測量不同時期血管瘤組織和正常皮膚組織bad表達的平均光密度和平均陽性面積。結果： 圖像分析結果顯示,增生期組的平均光密度為0.0496±0.0152；退化期組的平均光密度為0.1751±0.0349；正常皮膚組的平均光密度為0.0524±0.0164。增生期組的陽性面積率為0.1047±0.0103；退化期組的陽性面積率為0.2943±0

3、.0371；正常皮膚組的陽性面積率為0.1103±0.0132 。經q檢驗，退化期組與增生期組、退化期組與正常皮膚組之間，bad的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P0.01）, 增生期組與正常皮膚組之間平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性（P0.05）。結論： bad通過誘導血管瘤內皮細胞的凋亡而促進血管瘤由增生向退化的轉變。 關鍵詞：; bad；; 血管瘤；; 凋亡；; 免疫組織化學; 血管瘤是嬰幼兒最常見的一種良性腫瘤，其發病率約為10%，男女比例為1:3。目前成人病例也不少見。這種良性腫瘤在嬰幼兒出生后通過內皮細胞的增生而快速生長，雖然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退

4、化的血管瘤。如果位于顏面、顱內及口腔可引起明顯的畸形及功能障礙，持續發展則可產生潰瘍、出血、感染等一系列并發癥；位于顏面及口腔的血管瘤可引起明顯的外觀畸形及功能障礙，嚴重影響患者的身心健康。臨床治療手段主要包括：手術切除、冷凍、栓塞、硬化劑注射治療、激素、干擾素治療、各種激光治療等1,2。這些治療手段普遍存在損傷大，有一定副作用等缺點。不但效果欠佳而且給病人帶來極大痛苦。如皮質激素被認為是治療血管瘤的首選藥物，對增生期血管瘤有效率為30%903，但是同時它存在的副作用有延遲骨架生長、損害機體的免疫能力等4。因此尋找一種有效的治療手段對血管瘤患者有重要意義。細胞凋亡（apoptosis）是多細胞

5、有機體為調控機體發育、維持內環境穩定由基因調控的細胞主動死亡過程。血管瘤自發消退的過程中無炎癥反應，無組織壞死，非常符合凋亡的過程，因此許多研究者推測可能是由于增殖的血管內皮細胞凋亡導致血管瘤自發消退。促凋亡基因bad是bcl2家族中的一員,其對血管瘤的發生、發展及其退化的研究尚未見文獻報道。為此我們應用免疫組織化學方法和圖像分析技術檢測血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中bad的表達水平，以探討bad基因在血管瘤發生、發展過程中的作用機制。 1; 材料與方法 11; 材料 111; 材料來源; 收集武漢大學人民醫院病理科20022006年皮膚血管瘤存檔蠟塊50例，其中男性25例，女性25例

6、。血管瘤所在的部位主要有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等。患者術前均未做任何輔助性治療。 112; 材料分組; 蠟塊切片厚5m，貼片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。常規HE染色和免疫組織化學SP法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標準并結合PCNA的表達進行分組：增生期血管瘤22例，退化期血管瘤28例。另取瘤組織周圍正常皮膚組織5例作對照。 12; 主要試劑和儀器 121; 主要試劑; 即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體（北京中山生物技術有限公司）； 即用型兔抗

7、人因子相關抗原多克隆抗體（北京中山生物技術有限公司）； 濃縮型鼠抗人bad單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）； 超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒（福州邁新生物有限公司）； DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術有限公司）。122; 主要儀器; YWY781型醫用微波儀(250W，50Hz)，浙江臨安電子器材廠生產；家用高壓鍋。 13; 方法 131; 常規HE染色; 取材、固定、脫水、透明、切片和HE染色。 132; 免疫組織化學SP法檢測bad、PCNA和因子相關抗原; 主要步驟： 組織切片5m，常規脫蠟至水，蒸餾水洗； 3%過氧化氫37孵育10min以抑制內源性過氧化物

8、酶活性，PBS洗4×5min； bad采用微波抗原修復（3檔，10min），PCNA采用高壓抗原修復，因子相關抗原采用胃酶消化修復抗原，PBS洗4×5min； 正常羊血清37孵育10min以減少非特異性反應； 一抗（bad，1: 150；)37孵育1 h，PBS洗4×5min； 生物素標記的二抗，37孵育10 min，PBS洗4×5min； 鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復合物37孵育10 min，PBS洗4×5min； DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應； 蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，人扁桃體作為bad的陽性對

9、照，人正常皮膚表皮作為PCNA的陽性對照。 133; 免疫組織化學結果判斷; bad和因子相關抗原以胞膜或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，PCNA以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照除細胞核染成藍色外，胞核和胞漿內無棕黃色反應物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統（同濟千屏影像公司）對bad的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中

10、細胞的總面積×100） 134; 統計學處理; 對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和SNKq檢驗，檢驗水準為0.05。 2; 結果 21; PCNA的表達增生期血管瘤內皮細胞核內彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達強。退化期血管瘤內皮細胞核被蘇木精染成藍色，胞核內有少量棕黃色顆粒，PCNA表達弱。 22; 因子相關抗原的表達增生期和退化期血管瘤內皮細胞胞漿內彌漫分布棕黃色顆粒。 23; bad的表達退化期血管瘤內皮細胞胞漿內棕黃色顆粒較多；增生期血管瘤內皮細胞胞漿內無棕黃色顆粒；正常皮膚組織血管內皮細胞胞漿內無棕黃色顆粒。圖像分析結果顯示：增生期組的平均光密度為0.0496±0.0152；退化期組的平均光密度為0.1751±0.0349；正常皮膚組的平均光密度為0.0524±0.0164。增生期組的陽性面積率為0.1047±0.0103；退化期組的陽性面積率為0.2943±0.0371；正常皮膚組的陽性面積率為0.1103&#