1、實驗五細菌芽孢染色山東大學生命科學學院09級四班張行潤200900140177摘要細菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色（芽孢呈無色透明狀）。芽孢染色法就是根據芽孢既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽孢染色法都基于一個原則：除了用著色強的染料外，還須要加熱，以促進芽孢著色，再使菌體脫色，而芽孢上的染料則難以滲出，故仍保留原有的顏色，然后用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽孢呈現出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。關鍵詞芽孢（gemma of a fungus） 芽孢染色法（Spore staining） 復

2、染（counterstain）前言細菌的芽孢的某些細菌的特殊結構。芽孢是某些細菌生長到一定階段在體內形成的一個圓形或橢圓形的休眠體，它對不良環境具有很強的抗性。在合適條件下，可吸水萌發，重新形成一個新的菌體。芽孢的大小、形狀及其在菌體內的位置是鑒定細菌的重要依據。在一般實驗室中通常用芽孢染色法來觀察其形態。此外，由于芽孢具有很強的抗性，因此在生產實踐中都以是否有殺死抗性最強的芽孢來評定高溫滅菌及某些化學殺菌劑的效果。一、 實驗目的1. 學習并掌握芽孢染色法2. 了解芽孢桿菌的形態特征3. 鞏固顯微鏡操作技術及無菌操作技術二、 實驗原理芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細菌生長到一定階段形成的一種抗逆性很

3、強的休眠體結構，液被稱為內生孢子，通常呈圓形或橢圓形。細菌能否形成芽孢及芽孢的形狀，著生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鑒定細菌的重要指標。與正常細胞或菌體相比，芽孢壁厚、透性低而不易著色，但是芽孢一旦著色就很難被脫色。利用這一特點，首先用著色能力較強的染料，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出。再用對比度大的復染劑（如番紅液）染色后，菌體染上復染劑顏色，而芽孢仍為原來的顏色，這樣就可以將兩者區別開來。三、 實驗器材A. 菌種枯草芽

4、孢桿菌，梭狀芽孢桿菌B. 溶液和試劑5%孔雀綠溶液，0.5%番紅水溶液C. 儀器和其它用品酒精燈，酒精，木夾，香柏油，二甲苯，載玻片，蓋玻片顯微鏡，香柏油，擦鏡紙和接種針等四、 實驗內容1) 制片按常規涂片、干燥、固定。2) 染色加數滴5%孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱至染料冒蒸汽并開始計時。維持5min。加熱過程中及時補充染液。切勿讓涂片干涸。3) 水洗待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。 4) 復染用0.5%番紅染液復染1.5min 。 5) 水洗用緩流水洗后，干燥。6) 鏡檢先低倍鏡，再高倍鏡，最后油鏡觀察。五、 實驗結果芽孢呈綠色，芽

5、孢囊及營養體為紅色?？莶菅挎邨U菌芽孢呈橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，菌體基本無大變化；梭狀芽孢桿菌芽胞呈圓形，比菌體粗，位于菌體頂端，使細菌呈鼓槌狀。 圖一：枯草芽孢桿菌（10×100） 圖二：梭狀芽胞桿菌（10×100）芽孢呈綠色，芽孢囊及營養體為紅色六、 實驗分析由于芽孢壁厚、透性低上不易著色，當用番紅、結晶紫等進行單染色時，菌體和芽孢囊著色，而芽孢囊內的芽孢不著色或僅顯很淡的顏色，游離的芽孢呈淡紅或淡藍紫色的圈。但是用著色力強的染色劑孔雀綠，在加熱條件下染色，使染料不僅進人菌體也可進人芽孢內，進人菌體的染料經水洗后被脫色，而芽孢一經染色便難以被水洗脫。當用對比度大的

6、復染色劑番紅染色后，芽孢仍保留初染劑孔雀綠的綠色，而菌體和芽孢囊被染成復染色劑的顏色，使芽孢和菌體更易于區分。另外，要保證本實驗獲得成功，必須要注意以下幾點ü 選用適當菌齡的菌種，幼齡的尚未形成芽孢，而老齡菌芽孢囊已破裂ü 加熱染色時必須維持在染液微冒蒸汽的狀態，加熱沸騰會導致菌體或芽孢囊破裂，如熱不夠則難以著色ü 脫色必須等玻片冷卻后進行，否則驟然用冷水沖洗會導致玻片破裂實驗小結此次芽孢染色實驗，首先，收獲的當然是芽孢染色方法。其次，對芽孢有了一個系統的認識，認識到了多種形態的芽孢和芽孢對于細菌的重要性，芽孢不僅僅是生物的休眠體，芽孢的各種特性還是進行生物物種鑒定和分析的重要依據，通過本次試驗，我對細菌的芽孢的描述方法也有了一定的了解。相信本次實驗會對以后的學習和研究等方面大有幫助。參考文獻² 詹火元 生物學通