1、不同來(lái)源降香中柚皮素與異甘草素含量的高效液相色譜測(cè)定 10-08-22 14:04:00 編輯：studa20 作者：孫麗麗，王蕾，郭麗冰，沈志濱【摘要】 目的建立高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定降香中柚皮素和異甘草素含量的方法，比較不同來(lái)源的11批降香藥材中的柚皮素和異甘草素的含量。方法采用HPLC法測(cè)定，以甲醇-0.2%磷酸水(6040) 為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為372nm（柚皮素）和290 nm（異甘草素）。結(jié)果柚皮素在0.9484.740 g范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.999 9；異甘草素在1.43210.024 g范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.999 9。降香中的柚皮素含量在2.5855.4

2、29 mg/g之間；異甘草素含量在7.52628.329 mg/g之間。結(jié)論不同來(lái)源的降香藥材中的柚皮素和異甘草素含量差異較大。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適用于降香的質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法； 降香； 柚皮素； 異甘草素降香Lignum dalbergiae Odoriferae主要含有揮發(fā)油和黃酮類(lèi)成分。中國(guó)藥典中對(duì)于降香的質(zhì)量控制僅限于規(guī)定降香醇溶性浸出物不得少于8.0%1，但是對(duì)單一成分未有明確的定量方法。本課題組對(duì)降香黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了研究，從中分離得到7個(gè)化合物2。本文用自制的柚皮素和異甘草素為指標(biāo)，建立HPLC含量測(cè)定方法，并測(cè)定了11個(gè)不同來(lái)源的降香藥材中的柚皮

3、素和異甘草素含量。1 儀器與試藥 Waters高效液相色譜儀（四元泵，二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣）；柚皮素、異甘草素對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)UV、1H-NMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算，純度大于98%）；甲醇為色譜純、乙醇等試劑為分析純。 本實(shí)驗(yàn)所用降香樣品的來(lái)源見(jiàn)表1。表1 不同來(lái)源降香樣品（略）2 方法與結(jié)果2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取柚皮素對(duì)照品4.74 mg于5 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.948 mg/ml溶液，再經(jīng)0.45 m濾膜濾過(guò)得柚皮素對(duì)照品溶液。 精密稱(chēng)取異甘草素對(duì)照品7.16 mg于5 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成

4、質(zhì)量濃度為1.432 mg/ml溶液，再經(jīng)0.45 m濾膜濾過(guò)得異甘草素對(duì)照品溶液。2.2 供試品溶液的制備按照正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，精密稱(chēng)取各樣品粗粉2 g，在90下用70%乙醇提取3次，1.5 h/次，合并提取液，蒸干。殘留物用70%乙醇溶解并定容至25 ml。經(jīng)0.45 m濾膜濾過(guò)得供試品溶液。2.3 HPLC含量測(cè)定2.3.1 色譜條件色譜柱為迪馬公司Diamonsil C18(200 mm4.6 mm，5 m)色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水(6040)；體積流量為1.0 ml/min；柚皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)為372 nm，異甘草素的檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；進(jìn)樣量為10 l；柱溫30。2.3

5、.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 紫外掃描柚皮素對(duì)照品溶液顯示其最大吸收在372 nm處，異甘草素對(duì)照品溶液最大吸收為290 nm。因此以此波長(zhǎng)作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。2.3.3 線(xiàn)性關(guān)系考察柚皮素工作曲線(xiàn)：按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別吸取柚皮素對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 l進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。以峰面積10-6為縱坐標(biāo)，樣品量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算得回歸方程為Y=5.570 6X -1.8206，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍是0.9484.740 g。表2 柚皮素進(jìn)樣量與峰面積（略） 異甘草素工作曲線(xiàn)：按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別吸取異甘草素對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，7

6、 l進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。以峰面積10-6為縱坐標(biāo)，樣品量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算得回歸方程為Y=3.521 8X -1.575 2，r=0.999 5，線(xiàn)性范圍是1.43210.024 g。表3 異甘草素進(jìn)樣量與峰面積（略）2.3.4 精密度考察精密吸取柚皮素對(duì)照品溶液5l，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積，連續(xù)操作7次。測(cè)定結(jié)果為 =4.685g，RSD=0.61%(n=7)。說(shuō)明儀器精密度良好。 10-08-22 14:04:00 編輯：studa202.3.5 穩(wěn)定性考察精密吸取降香供試品溶液5 l，在0，1，3，6，12 h，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定柚皮

7、素和異甘草素的峰面積，分別以柚皮素和異甘草素工作曲線(xiàn)計(jì)算。柚皮素的測(cè)定結(jié)果為 =4.668 g，RSD=0.47%(n=5)，提示樣品中柚皮素含量在12 h內(nèi)穩(wěn)定。異甘草素測(cè)定結(jié)果為 =7.092 g，RSD=1.01%(n=5)，提示樣品中異甘草素含量在12 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表4。表4 柚皮素和異甘草素穩(wěn)定性考察（略）2.3.6 重復(fù)性考察取同一號(hào)樣品5份，按供試品溶液制備方法平行處理，依法測(cè)定，求得RSD為1.43%。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。2.3.7 各樣品的含量測(cè)定精密吸取樣品溶液10 l，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定柚皮素的峰面積，以柚皮素的工作曲線(xiàn)計(jì)算各樣品中的柚皮素含量，同樣測(cè)

8、定異甘草素的峰面積，以異甘草素的工作曲線(xiàn)計(jì)算各樣品中的異甘草素含量。結(jié)果見(jiàn)表5。表5 各樣品中柚皮素和異甘草素含量（略） 本實(shí)驗(yàn)對(duì)11個(gè)市售降香藥材的分析表明，降香中的柚皮素含量在2.5855.429 mg/g之間，異甘草素含量在7.52628.329 mg/g之間。 降香樣品（以樣品1為例）在372 nm和290 nm下的HPLC圖譜見(jiàn)圖12。3 討論 降香中含有多種黃酮類(lèi)成分。其中，本實(shí)驗(yàn)已分離出的柚皮素和異甘草素含量較大且其藥理活性與降香藥材的藥理作用相似，故選用這兩種化合物為指標(biāo)測(cè)定含量，為降香的質(zhì)量控制奠定理論基礎(chǔ)。 通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)提取總黃酮的次數(shù)、時(shí)間、溫度和乙醇濃度進(jìn)行了考察

9、，確定了本文的提取方法。 本實(shí)驗(yàn)選用的兩種對(duì)照品異甘草素和柚皮素經(jīng)紫外掃描分別在290 nm和372 nm處有最大吸收。使用PDA檢測(cè)器，得到200400 nm范圍內(nèi)的全波長(zhǎng)圖譜，分別選取290 nm和372 nm下的HPLC分離得到的紫外吸收?qǐng)D譜，建立各自的工作曲線(xiàn)，并測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)下的峰面積從而定量。 選擇流速1.0 ml/min，調(diào)整甲醇、水的比例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩者比例為64時(shí)分離較好，但是峰形不夠好。所以在流動(dòng)相中加入一定比例的磷酸，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水(6040)時(shí)，異甘草素和柚皮素的峰均能較好的與其他峰實(shí)現(xiàn)分離。 實(shí)驗(yàn)表明降香藥材中的異甘草素含量高于柚皮素含量。從廣西購(gòu)入的降香中

10、柚皮素與異甘草素含量均較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同來(lái)源的降香藥材中柚皮素與異甘草素的含量差異較大。 本研究建立了HPLC法測(cè)定降香中柚皮素和異甘草素含量的方法，該方法線(xiàn)性關(guān)系及重現(xiàn)性良好，方法穩(wěn)定準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便。【參考文獻(xiàn)】 1國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:158.2郭麗冰，王蕾.降香中黃酮類(lèi)化學(xué)成分研究J.中草藥，2008，39(8):1147. 10-08-22 14:04:00 編輯：studa202.3.5 穩(wěn)定性考察精密吸取降香供試品溶液5 l，在0，1，3，6，12 h，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定柚皮素和異甘草素的峰面積，分別以柚皮素和異甘草素工作

11、曲線(xiàn)計(jì)算。柚皮素的測(cè)定結(jié)果為 =4.668 g，RSD=0.47%(n=5)，提示樣品中柚皮素含量在12 h內(nèi)穩(wěn)定。異甘草素測(cè)定結(jié)果為 =7.092 g，RSD=1.01%(n=5)，提示樣品中異甘草素含量在12 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表4。表4 柚皮素和異甘草素穩(wěn)定性考察（略）2.3.6 重復(fù)性考察取同一號(hào)樣品5份，按供試品溶液制備方法平行處理，依法測(cè)定，求得RSD為1.43%。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。2.3.7 各樣品的含量測(cè)定精密吸取樣品溶液10 l，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定柚皮素的峰面積，以柚皮素的工作曲線(xiàn)計(jì)算各樣品中的柚皮素含量，同樣測(cè)定異甘草素的峰面積，以異甘草素的工作曲線(xiàn)計(jì)算各樣

12、品中的異甘草素含量。結(jié)果見(jiàn)表5。表5 各樣品中柚皮素和異甘草素含量（略） 本實(shí)驗(yàn)對(duì)11個(gè)市售降香藥材的分析表明，降香中的柚皮素含量在2.5855.429 mg/g之間，異甘草素含量在7.52628.329 mg/g之間。 降香樣品（以樣品1為例）在372 nm和290 nm下的HPLC圖譜見(jiàn)圖12。3 討論 降香中含有多種黃酮類(lèi)成分。其中，本實(shí)驗(yàn)已分離出的柚皮素和異甘草素含量較大且其藥理活性與降香藥材的藥理作用相似，故選用這兩種化合物為指標(biāo)測(cè)定含量，為降香的質(zhì)量控制奠定理論基礎(chǔ)。 通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)提取總黃酮的次數(shù)、時(shí)間、溫度和乙醇濃度進(jìn)行了考察，確定了本文的提取方法。 本實(shí)驗(yàn)選用的兩種對(duì)照品異甘草素和柚皮素經(jīng)紫外掃描分別在290 nm和372 nm處有最大吸收。使用PDA檢測(cè)器，得到200400 nm范圍內(nèi)的全波長(zhǎng)圖譜，分別選取290 nm和372 nm下的HPLC分離得到的紫外吸收?qǐng)D譜，建立各自的工作曲線(xiàn)，并測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)下的峰面積從而定量。 選擇流速1.0 ml/min，調(diào)整甲醇、水的比例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩者比例為64時(shí)分離較好，但是峰形不夠好。所以在流動(dòng)相中加入一定比例的磷酸，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水(6040)時(shí)，異甘草素和柚皮素的峰均能較好的與其他峰實(shí)現(xiàn)分離。 實(shí)驗(yàn)表明降香藥材中的異甘草素含量高于柚