1、FACSDiva操作說明書首先熟悉一下Diva的操作界面1 通過點擊菜單欄的相應的按鈕，可以隱藏或展開相應的模塊2 Browser通過Browser，可以對數據庫進行管理，Browser列出了文件夾、實驗、及實驗所包含的樣本和管子。 3 Acquisition control 對獲取和記錄數據進行操作4 Instrument 儀器設置儀器框顯示了儀器連接狀態，當打開一個實驗，試管指向定位于一個試管時，這個框顯示的是當前試管的儀器設置。5 瀏覽框 瀏覽框顯示了 worksheet或者 Browser中選中的部件的屬性，可進行修改。6 worksheetWorksheet框，可進行畫圖、設門、設邏

2、輯關系，進行統計等。7獲取狀態顯示了獲取或記錄數據時的狀態。在基本熟悉Diva的界面后，下面就進行一個實驗。在Diva軟件上進行操作，必須先新建一個實驗（實驗必須建立在文件夾中）。下面描述的是如何使用這些命令：Creating a Folder and an Experiment這部分描述了如何創建一個Practice文件夾和包含有基礎分析的實驗。1、在瀏覽框的菜單欄中單擊2、重命名為Practice，如下圖3、選擇Practice文件夾，點擊瀏覽框菜單欄的在文件夾下就創建了一個新的實驗，這個實驗包含了默認的儀器設置和一個空白的global worksheet。4、點及增加Specimen快捷

3、鍵，可加一個樣本和試管。5、瀏覽框中點擊左邊的樣本指向，指向tube-001。樣本指向變成綠色，說明當前Expriment和Acquizition control中顯示該tube的屬性。6、在Browser中選擇每一項，看看Inspector框的變化。當tube-001被選擇時，在Inspector中可以看到有四個標簽，分別點擊看看變化。在這版軟件中，一些儀器設置不能在Inspector中修改。當與流式細胞儀相連接時，可以在Instrument框中改變電壓、域值和補償。7、選擇ExprimentExpriment Layout，對每個參數進行定義，如下圖。當你的實驗包含有很多試管時，你可以用E

4、xpriment Layout 來一次標記所有試管。8、在Expriment Layout 對話框中，點擊Acquisition標簽，選擇Tube-001，改變計數粒子為10000，點擊OK。當你在瀏覽框中選擇Tube001時，在Inspector中的Labels和Acqui中的選項也隨著改變。9、在Global worksheet中創建一個FSC vs SSC點圖在worksheet菜單欄中點擊，再在worksheet中點擊一下，就創建了一個默認大小點圖。10、在FSC vs SSC點圖中邊上創建一個PE直方圖在worksheet菜單欄中點擊直方圖工具，再點擊worksheet，一個默認大小

5、的直方圖就建立好了。點擊X軸標簽，在下拉菜單中選擇PE-A，可改變圖的參數。注意參數的名字是你先前設定的參數名。11在FSC vs SSC點圖下面創建一個FITC vs PerCP-Cy5.5的點圖按住Ctrl鍵，點擊FSC vs SSC圖的邊緣，往下拖。當你拖的時候，就創建了一個復制的點圖。把點圖放在合適的位置，松開鼠標，這個方法可以復制任何的點圖。點擊坐標軸，選擇合適的參數。12創建一個Population HierarchyPopulation Hierarchy是用來列出定義的亞群。右擊任何點圖，選擇Show Population Hierarchy，把結果圖拖到FITC vs Per

6、CP-Cy5.5點圖的右側。Worksheet應該看起來類似于下圖：Exporting an Experiment as a Template現在已經創建好一個實驗了，可以導出成為一個模板。實驗模板包括了樣本、試管、關鍵詞、儀器設置、標簽、worksheet上的圖以及worksheets（包括所有設置，如分頁），但不包含有數據。 一個實驗可以保存為一個模板，為了簡化瀏覽框，模板不通過瀏覽框選擇。1、在瀏覽框中選擇Expriment-001，再選擇FileExportExpriment Template。確定選擇的是Expriment Template 命令，而不是Expriment命令。Exp

7、ort Experiment Template Wizard出現，對話框上的黑體字告訴你每個框的作用2在模板類型中輸入Practice，模板名字中輸入Simple Analysis。模板類型用來對類似的模板進行分組，以便于查找。當你在創建一個模板時，至少要輸入類型和名字，后面的選項是可選項。3點擊Next，可查看后面的選項，點擊Finish。Creating an Experiment from a Template現在可以用原來保存的模板來創建一個實驗。記住當你想在一個文件夾中創建一個實驗時，首先要選擇文件夾。1、選擇Practice文件夾，選擇Experiment New Experime

8、nt。當你想用原來保存的Exprement模板時，使用菜單欄而不是快捷鍵，你也可以按Ctrl-E。Experiment Templates對話框出現2、在對話框中，點擊Practice標簽，選擇Simple Analysis template，點擊鍵。Experiment Layout 對話框出現，顯示試管標記、關鍵詞、模板的設置等。3點擊Experiment Layout對話框中的各種標簽，查看設置，然后點擊Cancle。這些設置是你建立模板時設定的，注意：這些數據是只讀的，不能修改。4點擊OK建立一個新的實驗注意原先的實驗已經關閉，一個新的實驗Simple Analysis在瀏覽框中。當你

9、在做實驗時，一次只能打開一個實驗。注意global worksheet中包含有點圖和Population Hierarchy，在點圖中沒有數據。Importing an Experiment接下來，你將在Practice文件夾中導入一個實驗。導入實驗與導入模板的不同之處在于它們包含有記錄的數據。1、選擇Practice文件夾，選擇FileImportExpriments默認情況下，當導入一個實驗時，D:BDExportExperiment folder將會出現，除非你以前改變路徑導向到另一個文件夾。2、選擇命名為Manual Comp的文件夾，點擊Import。導入的實驗都是以文件夾形式出現，

10、文件夾在導入后在瀏覽框中將會以實驗Expriment出現。注意原先的實驗沒有關閉，新的實驗加在Simple Analysis Experiment后面有三種方法在瀏覽框中增加實驗：1、用瀏覽框工具欄中的快捷鍵來新建一個空的實驗（默認條件設置）。2、ExprimentNew Expriment命令新建一個新的實驗，實驗來自于一個原來保存的模板，模版包含下列部分：點圖、門、統計圖和儀器設置。3、FileimportExpriment命令，可新建一個實驗，通過這個方法獲得的實驗包括原來保存的實驗條件等和數據。Working with Experiments in the Browser現在在瀏覽框中

11、有三個實驗，一個關閉的實驗 (Experiment_001), 一個打開的實驗模板(Simple Analysis)和一個關閉的導入的實驗 (Manual Comp)。接下來的練習來證明關閉和打開的實驗之間的不同，以及如何來比較儀器設置。1、點擊Manual Comp Experiment前面的（+），展開實驗。盡管在browser框中顯示出實驗組分，但點圖依舊是空白的，你必須打開一個實驗來獲得它的數據。注意：展開一個實驗和雙擊打開一個實驗是不同的2、雙擊Manual Comp Experiment來打開Simple Analysis Experiment關閉，在worksheet中顯示Man

12、ual Comp Experiment中的分析目標。3、點擊其中一個實驗樣本Manual Comp Experiment中，在每個樣本下面含有多個試管，注意每個試管都是綠色的，說明每個試管都包含有數據。4、點擊試管指示到任何一個試管。在global worksheet中包含有點圖、試管中含有數據，數據就顯示在worksheet中，可用試管指示來定位試管，則將顯示所選擇試管的數據。5、在browser中選擇其它試管注意：數據并沒有改變，必須依靠試管指示，才能在global worksheet中顯示其他試管的數據。嘗試把試管指示指向另一個試管，注意數據的變化。6、展開Simple Analysis

13、 Experiment，選擇Instr Settings。注意Inspector上的儀器設置是所選Instru settings的設置，盡管實驗已經關閉。7點擊Instrumengt框中的各個參數Instrment框顯示了試管指示所對應的試管的儀器設置（Manual Comp Experiment中的tube）。Inspector顯示的是試管的設置或者是所選擇的Instr Settings的設置。在這個例子里，Inspector顯示的是Simple Analysis Experiment實驗的儀器設置，你可以用Instrument框和Inspector來比較瀏覽器中的任何兩個儀器設置。顯示的是

14、Manual Comp_001中PE試管的儀器設置顯示的是simple Analysis_001的instru Settings的儀器設置Using Gating Features在BD FACSDiva軟件中：可以創建四種類型的門：polygon、rectangle、quadrant和interval。自動圈門工具Automatic和Snap-To門工具可用來設置polygon和interval門。在這一節中，你需要先前所建立的Simple Analysis 和Manual Comp 實驗。Creating Gates這部分說明了在Manual Comp Experiment中怎么用work

15、sheet中的菜單欄來設不同的門：1、打開Manual Comp Experiment2、把試管指向對準Calibrite樣本下的Pre Sort試管，如下圖：3、在FSC vs SSC點圖上建一個Autopolygon門選中worksheet菜單欄的（Autopolygon）工具。在點圖中點擊粒子，一個門將會自動地畫成。4、試管指示指向下一個試管，可以看到一些粒子在門外。5、選擇FSC vs SSC圖的Autopolygon門，Delete按Delete鍵而不是Backspace鍵，如果Delete鍵不工作的話，右擊門，選擇delete。這將會激活Delete鍵，下次就可以使用。6、在FSC

16、 vs SSC點圖上創建Snap-To polygon門Snap-To polygon和autopolygon門不同，Snap-To polygon門自動重新計算。可看見Snap-To polygon門的邊框比較粗。7、把試管指示回到Pre Sort 試管，注意門的變化。8、（可選）用其它設門工具進行練習，在點圖上去除Snap-To門，創建一個Rectangle門（）和一個Polygon門（）Editing Gates這部分描述怎樣移動和改變門的大小1、選中FSC vs SSC點圖上的門，在每個頂點上會出現一個把手。2、移動選中的門移動門的時候，選擇門的邊，而不是頂點，可看到門的標簽隨著門一起

17、移動3、拖動其中的一個把手來改變門的大小在你移動或者改變Snap-To門時，門將不會自動調準。你可以通過右擊門的邊，選擇下拉菜單中的重新計算。4、通過拖動門內的標簽，可把標簽拖到門外5、在門外點擊，釋放門6、關閉Manual Comp Experiment.Subsetting PopulationsSimple Analysis Expriment 包括三個點圖和一個Population Hierarchy。Population Hierarchy主要是用來查看各個門內群體關系。在這里，你需要原來創建的Simple Analysis Experiment，在軟件安裝時，樣本文件存在于BDEx

18、portFCS文件中。導入數據在你進行分群前，需要含有數據的點圖：1、通過雙擊來打開Simple Analysis Expriment，只有把實驗打開時，你才能導入數據。2、選擇FileImportFCSfiles通常，D:BDExportFCS文件出現，除非你原來改變過路徑3、雙擊4色文件，在雙擊Calibrite beads文件夾來打開。4、選擇文件中所有的FCS文件，點擊Import當導入FCS文件時，需要選擇文件，而不是文件夾，可以通過Shift和Ctrl鍵來選擇多個甚至全部。這樣就增加了一個新的樣本Calibrite Beads，含有四個帶數據的試管。5、在Calibrite bea

19、ds樣本中，把試管指向Tube-0016、在瀏覽框中選擇Tube-001，勾選Inspector中熒光參數前的Log Checkbox。7、對Calibrite Specimen實驗的其它試管做相同的操作Defining and Subsetting Populations1、Tube-001的FSC vs SSC點圖上，建立一個Autopolygon 門。新的P1群就在Population Hierarchy上出現。2、把標簽P1拖出Autopolygon gate（點中P1標簽，拖出門外）。3、建立一個只顯示P1群的PE直方圖右擊直方圖，選擇show population P1。在直方圖上

20、只顯示P1群體，注意到直方圖上所有的點都是紅色的，是P1的顏色。4、PE直方圖上，在PE陰性峰上創建一個Autointerval門（）Population Hierarchy圖上P2群顯示在P1群下面。當你在一個群下創建一個門，新的群體是原來群體的一個亞群。注意到P2旁邊的顏色框是一個十字叉，說明子群的顏色仍舊是其母群的顏色。默認情況下，Interval和Quadrant門定義的群體一般不會被授予顏色。5、點擊FITC vs PerCP-Cy5.5點圖，顯示P2群體在點圖上右擊，選擇show population P2點圖是空白的，因為P2群體沒有顏色，下面是給P2群體設置一個顏色：1）雙擊P

21、opulation Hierarchy前的顏色框2）選擇一個顏色6、在 FITC vs PerCP-Cy5.5點圖上建一個FITC陽性的Rectangle門。擴展門的邊越過X軸，可以包含有軸的粒子。因為點圖顯示的是P2的群體，新的P3群體是P2群體的一個子集。下面的步驟顯示另一種建群體的方法。7、設置FITC vs PerCP-Cy5-5點圖顯示全部的粒子Tip 你也可以用Inspector來顯示一個點圖的群體層次結構。8、Population Hierarchy中選擇P2群體，在PerCP-Cy5.5陽性群體上畫一個Autopolygon門。結果如下，可以看出新創建的P4群體是P2群體的一個

22、子集。在進行分群時為了避免錯誤，保持Population Hierarchy可視。在你改變群體的名字或者顏色時，你還是可以選擇群體。Gating Multicolor Experiments下面的教程說明了在用人外周血進行淋巴細胞亞群分析時，interval和quadrant門的特性。在這個實驗中，細胞用CD3 FITC, CD16+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, 和CD8 APC-Cy7進行染色進行這一步學習，您需要6-color Experiment（BDExportExperiment folder）。1、在Practic

23、e folder.中，導入6-Color gating選擇文件夾，選擇File > Import > Experiments，在BDExportExperiment folder中定位6-color gating。選擇文件，點擊導入。2、雙擊實驗，打開實驗3、展開lymphocytes樣本，試管指向定位在3/16+56/45/4/19/8試管，如下圖。在worksheet點圖中就會顯示數據4、在CD45 vs SSC點圖上，單核細胞和粒細胞上畫一個Rectangle門。Tip：把門延伸過點圖的軸，這樣就包含在軸上的點。5、在Population Hierarchy中把門命名為MNE

24、s（monocytes、neutrophils、eosinophils），選擇P1，輸入MNEs，enter。6、在Population Hierarchy圖中右擊MNEs，選擇 Invert Gate。在Population Hierarchy圖上就增加了一個新的群體（不包含單核細胞、粒細胞和嗜曙紅細胞）。7、右擊FSC vs SSC點圖，選擇顯示populationNoT（MNEs），結果如下圖。8、在淋巴細胞上畫一個Autopolygon gate ()，在Population Hierarchy上把這個群體命名為lymphocyte，結果如下圖，淋巴細胞是NOT MNEs的一個子集。I

25、dentifying Lymphocyte Subsets下面就把淋巴細胞分為T、B和NK細胞。1、右擊FSC vs SSC點圖上的淋巴細胞門，選擇 Drill down。一個新的FSC vs SSC圖出現，只顯示淋巴細胞。在一張點圖上定義了一個門后，通過Drill down就可以創建一個只顯示門內群體的點圖。2、在新的點圖上，把FSC換成CD3。3、在CD3+細胞上畫一個Interval gate（一般應用在直方圖上，在點圖上也適用），命名新的群體叫做T細胞。4、用類似的方法可以得到B、NK亞群5、按住ctrl鍵，在Population Hierarchy中選擇T、B和NK，右擊，選擇Joi

26、n Gates，在Population Hierarchy圖上就出現一個新的群體，是T、B、NK細胞的總合。Calculating Compensation Using Instrument SetupBD FACSDiva軟件可以自動的計算光譜的重疊值，在進行補償時，更加節約時間，更加精確。下面介紹如何使用Instrument Setup feature。Setting Up Compensation Controls1、打開Experiment_0012、編輯參數如果計算機與儀器相連，打開Specimen-001，把試管指針指向Tube-001，在Instrument框中編輯參數。如果脫機

27、操作，選擇Expriment下的instrument setting，在Inspector中編輯參數。3選擇 Instrument-Instrument setup-Create compensation controls。下面的對話框將出現4增加或者刪除對照，定義標記特異性對照，或者可以改變補償控制的順序。5點擊OK6展開Compensation Control specimen來查看補償對照。Creating an Instrument Configuration在Instrument Setup中，下一步就是記錄數據。為了計算補償，首先要把instrument configuration

28、設置成符合記錄數據的格式。1選擇 Instrument-Instrument Configuration2在Instrument Configuration對話框中，選擇Add Configuration3在Instrument Configuration對話框中，輸入2 laser, 4 color，點擊OK注意：確認你輸入的名字完全與圖上的相符，如果字符的空格或者大小寫與例子不符，在計算補償時，就會有一個錯誤信息。4在instrument configurations列表中，選擇2 laser，4 color，點擊Add Parameter鍵6次instrument configurati

29、on圖應該如下所示：5命名laser和detector，輸入每個參數的名字首先應該確定一個Detector，再改變參數的名字。可以通過查看其他的configuration來找到每個參數合適的laser和detector。通過相應column的下拉菜單來選擇所對應的設置，把參數的名字改為FSC、SSC、FITC、PE、PerCP和APC。6 點擊okImporting Data and Calculating Compensation現在已經設置好與我們試驗相符的confuguration，接下來就是導入數據。可以用原來記錄的數據（Sample expriment）來計算補償1選擇 Practi

30、ce folder ，從BDExportexperiment folder里導入AutoComp Expriment。選擇File- Import- Experiment，找到AutoComp Expriment 文件夾，點擊Import。2雙擊AutoComp Experiment打開實驗這個實驗包含有一個Compesation Specimen和四個熒光參數的試管3雙擊Unstained Control Tube，打開對應的worksheet4 在FSC vs SSC點圖上，移動P1門包含所有的陰性粒子5右擊門的邊框，選擇Apply to All Compensation Control。

31、6 雙擊第一個Stained Control Tube（FITC Stained Control），在worksheet打開相應的點圖。7確定P2門包含了所有的陽性顆粒。P2門是一個Snap-To Interval 門，已經包含了所有的陽性顆粒。如果一些顆粒在門外，右擊門，選擇recalculate。8雙擊下一個Stained control tube，打開相應的worksheet。9對下面的試管，重復7和8，當所有的門設定好后，你可以進行補償計算了。10選擇Instrument-Instrument setup-Calculate Compesation。 將會出現一個對話框，可以進行命名。

32、11 對于新的補償進行命名，點擊ok。一個新的設定，包括了參數和標記信息，閾值和電壓，計算好的補償。新的儀器設置儲存在Setup catalog下。Calculating Compensation Manually在進行下面實驗時，需要導入Manual Comp Experiment，進行手動補償時不需要鏈接儀器。Adjusting FITC Compensation這部分描述了怎樣計算FITC熒光的溢出，其他熒光也是類似的。1選中Compensation Controls Specimen樣本下的FITC Stained Control管。2 在FSC vs SSC點圖上創建一個Snap-T

33、o gate，如下圖3在worksheet上選擇FSC vs SSC點圖，右擊點圖，選擇Show Populations > P1。4在FITC-A vs PE-A點圖上，畫一個FITC陽性的Interval gate。在Population Hierarchy view圖上，進行重命名為FITC Positive。5在Population Hierarchy view圖上右擊FITC Positive，選擇Invert Gate，重命名為NOT (FITC Positive) population Negative，如下圖6 在Inspector框中顯示補償管，確定Enable Com

34、pensation checkbox 已經被選擇。7調節PE-%FITC熒光補償，直到，FITC陽性群體的熒光平均值與陰性對照的相同，如下圖。8用同樣的方法調節PerCP-CY5-5-%FITC、APC%FITC的熒光補償，結果如下圖。其他熒光通道可用相同的方法進行調節。Manually Constructing a Compensation Matrix進行補償完畢后，可以拷貝這些設置來進行實驗。1放大Inspetor框，這樣就可以看到整個補償網絡。2在Browser框中，右擊FITC Stained Control管，選擇Copy Spectral Overlap。3展開Calibrite

35、 Specimen，可以看到五個試管。4選擇Calibrite Specimen下的5個管子，右擊試管，選擇Paste Spectral Overlap。在數據拷貝后，在瀏覽器中選擇其中一個Calibrite Tube。在Inspector框中，可以看到FITC的補償網絡。如下圖5輪流拷貝其它的Spectral Overlap settings，粘貼到這五個試管。當完成后，結果應該如下圖在進行補償之后，就可以用相應的條件進行樣本檢測Tip：可以進行導出和導入的模版：Expriment、Template、Panel Template、Analysis Template、Settings、FCS

36、Files。Exporting Experiments1 在瀏覽框中選擇experiments2 選擇 File > Export > Experiments.3 在Export Experiments對話框中，進行合適的選擇，點擊OK。Importing Experiments1 選擇File > Import > Experiments.2 在對話框中選擇實驗文件夾或者Zip文件夾。3 選擇需要的文件，點擊Import。Exporting Experiments as Templates1右擊experiment，choose Export > Experim

37、ent Template，Export Wizard dialog出現。2輸入template type和模板名字（模版名字是進行區別的唯一標志），點擊next3下面是一些可選項進行選擇后，點擊Finish。Import a Template根據已經儲存的模板來建立一個實驗（不能用快捷鍵）choose Experiment >New Experiment or press Ctrl-E. 出現Experiment Templates dialog，進行選擇你所需的模板，最多可建立50個拷貝（實驗拷貝）。Exporting a Specimen as a Panel Template1Ri

38、ght-click the specimen、choose Export > Panel Template，Export Wizard dialog出現。2選擇你panel所需要的global worksheet，點擊next。3選擇template type，輸入名字，點擊next。4下面是一些可選項，點擊Finish。Importing a Panel Template選擇Experiment > New Specimen or press Ctrl-M，Panel Templates dialog出現，選擇方式與導入模板類似。進行選擇，最多50個拷貝（樣本拷貝）利用Panel

39、 Template（包含有實驗的儀器設置，分析方式）可對其他樣本進行分析，但是樣本中所包含的試管數必須同。右擊specimen，選擇Apply Panel Analysis，出現Panel Template dialog對話框，進行選擇，點擊OK。Exporting a Analysis Template1 Right-click an Analysis icon（）, 或者含有 的tube或者global worksheet， choose Export > Analysis template。Export Wizard dialog出現。2選擇template type，確定名字，點

40、擊next。3下面是可選項，點擊ok。Creating a Tube with a Predefined Analysis Template1Choose Experiment > New Tube or press Ctrl-T。2Analysis Templates dialog出現，進行選擇，點擊OK。最多進行50個拷貝（Tube數）。Creating Specimen- or Tube-Specific Settings1 右擊瀏覽框Cytometer Settings圖標()，選擇Export to the Instrument folder。2 輸入文件名稱，點擊Export.3 默認情況下文件會儲存在D:BDExportInstrument中。Importing Settings1 在瀏