1、免疫學技術有在食品安全免疫學技術有在食品安全 檢測中的應用檢測中的應用抗原的準備抗體的制備 常用的免疫學檢測技術第一節抗原的準備第一節抗原的準備l天然抗原的制備l人工抗原的制備l合成抗原抗原制備的主要技術途徑抗原制備的主要技術途徑天然抗原分離、純化半抗原人工合成、載體聯接抗原肽 合成、基因工程制備天然抗原的制備天然抗原的制備l顆粒抗原的制備l可溶性抗原 蛋白抗原 多糖抗原 顆粒抗原的制備顆粒抗原的制備1、血紅細胞抗原的制備：動物的新鮮血液+抗凝劑 離心去上清 NS懸浮 離心洗滌三次（2000轉/分） 綿羊紅細胞的制備流程圖44可保存可保存3 3周周 取適量取適量 NSNS洗滌洗滌3 3次次20

2、00r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀釋至稀釋至 2 25% 5% 搖動15-20min顆粒抗原的制備顆粒抗原的制備2、細菌抗原的制備 細菌培養（37 ，24小時） 殺菌（100 ，2小時） NS稀釋 菌體抗原 細菌細胞抗原的制備流程圖液體培養或液體培養或 斜面培養斜面培養 3724h3724h100100水浴水浴 2 22.5h2.5h 殺菌殺菌無活菌試驗無活菌試驗NSNS稀釋成稀釋成8 81010億億/ml/mlO O菌體抗原菌體抗原種類：蛋白質多糖和細菌毒素。種類：蛋白質多糖和細菌毒素。細胞內存在的部位：胞外抗原和胞內抗原。細胞內存在的部位：胞外抗原和胞內抗原

3、。胞外抗原胞外抗原:收集培養液或分泌物。收集培養液或分泌物。胞內抗原胞內抗原:提取、分離和純化。提取、分離和純化。可溶性抗原的分離純化可溶性抗原的分離純化胞內抗原的提取、分離和純化l細胞的破碎細胞的破碎l分離純化分離純化 1.1.酶處理法酶處理法2.2.凍融法凍融法3.3.超聲破碎法超聲破碎法4.4.表面活性劑處理表面活性劑處理細胞的破碎細胞的破碎1、酶處理法、酶處理法常用酶類：常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等 特點：特點： 適用于多種微生物；適用于多種微生物； 作用條件溫和；作用條件溫和； 內含物成分不易受到破壞；內含物成分不易受到破壞； 細胞壁損壞的程度可以控

4、制。細胞壁損壞的程度可以控制。2、凍融法、凍融法 原理：原理：因突然冷凍，細胞內冰晶的形成及因突然冷凍，細胞內冰晶的形成及 胞內外溶劑胞內外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。濃度的突然改變而破壞細胞。 方法：方法：將待破碎的細胞置冰箱內凍結，然后緩慢融化，將待破碎的細胞置冰箱內凍結，然后緩慢融化，如此反復兩次，大部分組織細胞及細胞內的顆粒可被如此反復兩次，大部分組織細胞及細胞內的顆粒可被融破。融破。 特點：特點：適用于組織細胞，對微生物細胞作用較差。適用于組織細胞，對微生物細胞作用較差。3、超聲破碎法、超聲破碎法原理：原理：利用超聲波的機械振動而使細胞破碎。利用超聲波的機械振動而使細胞破碎。 超聲

5、波使用的頻率從超聲波使用的頻率從1kHz20kHz，間歇進行，避免長期超聲產熱，導致抗原破壞。間歇進行，避免長期超聲產熱，導致抗原破壞。特點：特點： 操作簡單，重復性較好，節省時間；操作簡單，重復性較好，節省時間； 多用于微生物和組織細胞的破碎。多用于微生物和組織細胞的破碎。4、表面活性劑處理法、表面活性劑處理法原理：原理： 在適當的溫度、在適當的溫度、pH及低離子強度的條件下，及低離子強度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。性改變或使之溶解。常用的有：常用的有： 十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型陰離子型)、

6、二乙胺、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。型）、新潔爾滅等。應用：應用： 破碎細菌，且作用比較溫和。破碎細菌，且作用比較溫和。抗原的純化抗原的純化l1.超速離心法超速離心法l2.選擇性沉淀法選擇性沉淀法l3.凝膠層析法凝膠層析法l4.離子交換層析法離子交換層析法l5.親合層析法親合層析法1、超速離心法、超速離心法l原理原理: 利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯處于不同密度的梯度層內，達到彼此分離的目的。度層內，達到彼此分離的目

7、的。l應用：應用： 用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質的分離，如原物質的分離，如IgM、載脂蛋白、載脂蛋白A、B等。等。2、選擇性沉淀法、選擇性沉淀法原理：原理： 根據蛋白質理化特性的差異，采用各種沉根據蛋白質理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉淀，淀劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。從而達到純化的目的。常用方法：常用方法： 鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同），鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同），常用常用3350飽和度的硫酸胺飽和度的硫酸胺。特點特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。簡單方便，

8、純度不高，粗提球蛋白。應用：應用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。在大量制備中先用此法粗提，再純化。3、凝膠層析法、凝膠層析法 原理：凝膠具有三維空間多孔網狀結構的物質，經適原理：凝膠具有三維空間多孔網狀結構的物質，經適當溶液平衡后，裝入層析柱。當含有各種分子大小不當溶液平衡后，裝入層析柱。當含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時，由于分子大小的不同先一的混合物加在凝膠床面時，由于分子大小的不同先后被洗脫出來，從而實現對不同分子大小的物質進行后被洗脫出來，從而實現對不同分子大小的物質進行分離。分離。 常用的如：如葡聚糖凝膠填料（常用的如：如葡聚糖凝膠填料（sephadex 柱）凝膠層析（

9、分子篩）凝膠層析（分子篩）4、離子交換層析法、離子交換層析法 原理：原理：利用帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶利用帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。各種蛋白質的等電點不同，相反電荷的蛋白質抗原。各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷不同，與纖維素結合的能力有差別。當梯度所帶電荷不同，與纖維素結合的能力有差別。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位與蛋白質競爭纖維素上的電荷位 置，從而使血清中的置，從而使血清中的蛋白質分成蛋白質分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等球蛋白和

10、清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。離子交換層析離子交換層析+5、親和層析法、親和層析法 原理：原理：依據抗原抗體的生物學活性進行分離和提純的依據抗原抗體的生物學活性進行分離和提純的技術。將純化的抗技術。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質上，制附著于惰性的固相基質上，制成免疫吸附層析柱。當樣品流過此柱時，待分離的成免疫吸附層析柱。當樣品流過此柱時，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗抗IgG)結合；當改變洗脫條件可重新解離，將待分離的結合；當改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗洗

11、脫下來，達到純化的目的。脫下來，達到純化的目的。 優點：優點：提取純度高、抗原抗體不失活性。提取純度高、抗原抗體不失活性。正常細胞正常細胞 標記細胞標記細胞洗滴洗滴標記細胞標記細胞被酶裂解被酶裂解加入特異加入特異性抗體性抗體其它蛋白其它蛋白洗滌流失洗滌流失SDS-PAGESDS-PAGE分離蛋白分離蛋白 親和層析法示意圖親和層析親和層析抗原的鑒定抗原的鑒定1.含量鑒定：凱氏定氮法含量鑒定：凱氏定氮法 2.理化性質鑒定理化性質鑒定 凝膠層析技術測定凝膠層析技術測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 凝膠管狀電泳凝膠管狀電泳 超速離心超速離心3.純度鑒定純度鑒定 常用醋酸纖維膜電泳常用醋酸纖維

12、膜電泳 4.免疫活性鑒定免疫活性鑒定 常用雙向瓊脂擴散試驗常用雙向瓊脂擴散試驗半抗原免疫原的制備半抗原免疫原的制備1.半抗原：半抗原： 低分子量的化學物質。例如多糖、多肽、甾族激素、低分子量的化學物質。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質、核苷、某些藥物脂肪胺、類脂質、核苷、某些藥物(包括抗生素）及其包括抗生素）及其他化學物品等。他化學物品等。2.載體：載體：蛋白質類蛋白質類 多肽聚合物多肽聚合物 大分子聚合物大分子聚合物3.半抗原半抗原-載體連接方法載體連接方法 BTBBBT載體類型載體類型1.蛋白質：蛋白質： 人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血

13、清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。甲狀腺球蛋白等。2.多肽聚合物：多肽聚合物： 人工合成的，常見的有多聚賴人工合成的，常見的有多聚賴 氨酸，其分子量大氨酸，其分子量大（可達十幾萬到幾十萬（可達十幾萬到幾十萬)，這種多聚物和半抗原結合后，這種多聚物和半抗原結合后，可刺激免疫動物產生高效價、高親和力的抗體。可刺激免疫動物產生高效價、高親和力的抗體。3.大聚合物：大聚合物： 羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，可與半抗原結羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，可與半抗原結合，加入弗氏完全佐劑亦可誘發動物產生抗體。合，加入弗氏完全佐劑亦可誘發動物產生抗體。 半抗原-載體連接方法1碳化二亞胺法：碳化二亞胺法：R-NH=

14、CH-RR-NH=CH-R半抗原載體蛋白質半抗原載體蛋白質攪拌攪拌1 12h2h室溫室溫2424h h透析除去未反透析除去未反應的半抗原應的半抗原人工免疫原人工免疫原混合混合混合混合戊二醛法戊二醛法: :半抗原半抗原-NH-NH2 2載體蛋白載體蛋白-NH-NH2 2半抗原半抗原-N=-N=CH-(CHCH-(CH2 2) )3 3-CH=-CH=NH-NH-載體蛋白載體蛋白OHC-(CHOHC-(CH2 2) )3 3-CHO-CHO* *戊二醛是常用的帶有兩個活性基團的雙戊二醛是常用的帶有兩個活性基團的雙 功能聯接劑功能聯接劑 半抗原-載體連接方法3氯甲酸異丁脂法：氯甲酸異丁脂法：半抗原半

15、抗原-COOH-COOH載體蛋白載體蛋白-NH-NH2 2Cl-COO-CHCl-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3) )2 2半抗原半抗原-COO-COO-CH-COO-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3) )2 2半抗原半抗原-CO-CO-NHNH- -載體蛋白載體蛋白簡便，用于類固醇抗原制備簡便，用于類固醇抗原制備HO-HO-CHCH2 2CH(CHCH(CH3 3) )2 2 半抗原-載體連接方法4琥珀酸酐法：琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備用于不含羧基衍生物半抗原制備半抗原半抗原-CH-CH2 2OHOHCHCH2 2-CO -CO CHCH2 2-CO

16、-CO 帶羧基的半抗原帶羧基的半抗原琥珀酸衍生物琥珀酸衍生物半抗原半抗原-CH-CH2 2-OOC-CH-OOC-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH吡啶吡啶再經氯甲酸異丁脂法或碳化再經氯甲酸異丁脂法或碳化二亞胺法制備載體半抗原二亞胺法制備載體半抗原 佐劑佐劑概念：概念： 能非特異地通過物理或化學方法與抗原結合從而增強能非特異地通過物理或化學方法與抗原結合從而增強其特異性免疫原性的物質。其特異性免疫原性的物質。條件：條件：增加抗原的表面積；增加抗原的表面積；改變抗原的活性基團構型；改變抗原的活性基團構型；佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間；佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組

17、織的存留時間； 可直接或間接激活免疫活性細胞可直接或間接激活免疫活性細胞 ；無毒性或無副作用。無毒性或無副作用。 （二）常用佐劑的種類和制備1.1.氫氧化鋁佐劑：氫氧化鋁佐劑：5%5%硫酸鋁硫酸鋁5%5%氫氧化鈉氫氧化鈉氫氧化氫氧化鋁沉淀鋁沉淀制成懸液制成懸液即為佐劑即為佐劑強烈攪拌強烈攪拌NSNS洗洗二次二次NSNS等體積抗原等體積抗原免疫接種免疫接種常用佐劑的種類及制備常用佐劑的種類及制備 2.2.明礬佐劑明礬佐劑10%10%硫酸鉀鋁硫酸鉀鋁氫氧化鈉校正氫氧化鈉校正pHpH值至值至6.56.5沉淀沉淀乳狀懸液乳狀懸液* * 明礬佐劑抗原常用于肌肉注射，皮下注射明礬佐劑抗原常用于肌肉注射，皮

18、下注射 易引起肉芽種和膿腫。易引起肉芽種和膿腫。NSNS攪拌攪拌NSNS洗洗二次二次離心離心抗原抗原備用備用防腐劑防腐劑作用大于不完全佐劑作用大于不完全佐劑局部形成肉芽種和潰瘍局部形成肉芽種和潰瘍不能用于人體不能用于人體弗氏完全佐劑弗氏完全佐劑 3.3.弗氏佐劑弗氏佐劑(Freund adjuvant)液體石蠟液體石蠟完全完全乳化乳化備用備用高壓高壓滅菌滅菌加熱加熱抗原抗原弗氏不完全佐劑弗氏不完全佐劑卡介苗卡介苗羊毛脂羊毛脂鑒定鑒定一滴一滴乳劑乳劑乳劑不散乳劑不散浮于液面浮于液面水中水中混合混合 增強抗原對機體的免疫原性；增強抗原對機體的免疫原性； 增強抗體的產生能力；增強抗體的產生能力； 為

19、制備出高效價的免疫血清；為制備出高效價的免疫血清； 在某種情況下，改變在某種情況下，改變AgAg免疫應答類型；免疫應答類型； 延長抗原在免疫動物的時間；延長抗原在免疫動物的時間； 增強局部對變應原的超敏反情況。增強局部對變應原的超敏反情況。佐劑的作用佐劑的作用人工抗原及基因工程抗原人工抗原及基因工程抗原l用化學合成法或基因重組法制備含有已知化學結構決定簇的抗原，稱之為人工抗原。l它可包括人工結合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。 人工合成抗原人工合成抗原l用化學方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽。應用這種人工合成多肽可作為抗原。l只由一種氨基酸形成的聚合體稱為同聚多肽，如由左旋賴氨酸形成的

20、同聚多肽。l由二種或二種以上氨基酸形成的聚合多肽稱為共聚多肽，如由酪氨酸、谷氨酸與多聚丙氨酸和賴氨酸組成的聚合成多肽。基因工程抗原基因工程抗原l 將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當載體DNA分子相結合，然后引入受體細胞中使之表達，即能獲得免疫原性之融合蛋白，經純化后即基因工程疫苗。l 基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表達系統中研制乙肝病毒的重組感染載體的多價疫苗。 小結小結l抗原的種類l顆粒性抗原的制備l可溶性抗原提取分離純化方法l抗原的鑒定l半抗原免疫原的制備l佐劑的作用 第二節第二節 抗體的制備抗體的制備l多克隆抗體的制備l單克隆抗體技術l基因工程抗體多克隆抗體的制備多克隆抗體

21、的制備l1.免疫動物選擇免疫動物選擇l2.免疫方法免疫方法l3.動物采血法動物采血法l4.免疫血清的分離及保存免疫血清的分離及保存 免疫動物的選擇免疫動物的選擇l能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。羊、豚鼠、雞、山羊和馬。l免疫動物的選擇原則：免疫動物的選擇原則：1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好；抗原與免疫動物種屬差異越遠越好；2.動物必須適齡、健壯、無感染的正常動物、動物必須適齡、健壯、無感染的正常動物、 體重合乎體重合乎要求；要求；3.不同動物種類對同一免疫原有不同的免疫應答；不同動物種類對同一免疫原有不同的

22、免疫應答；4.按需要量選擇大小不同的動物。按需要量選擇大小不同的動物。免疫方法免疫方法1.免疫原的注射劑量免疫原的注射劑量2.免疫途徑：免疫反應產生速度依次為靜脈免疫途徑：免疫反應產生速度依次為靜脈 腹腔肌肉皮下皮內淋巴結足掌腹腔肌肉皮下皮內淋巴結足掌3.免疫方案免疫方案 全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗微量免疫法：卡介苗 弗氏佐劑弗氏佐劑 抗原抗原 混合免疫法：綜合皮下、淋巴結和靜脈混合免疫法：綜合皮下、淋巴結和靜脈7天1月l1.頸動脈放血法頸動脈放血法l2.心臟采血法心臟采血法l3.靜脈采血法靜脈采血法動物采血法動物采血法免疫血清的分離和

23、保存免疫血清的分離和保存免疫血清的分離免疫血清的分離 1、室溫自然凝固，然后放置、室溫自然凝固，然后放置37或或4待凝待凝 塊收縮，分離血清。塊收縮，分離血清。 2、 抗血清分出后要經抗血清分出后要經5630min滅活。滅活。免疫血清的保存免疫血清的保存 1.4保存：可保存保存：可保存36個月個月 2.低溫保存：低溫保存：-20-40，可保存，可保存23年年 3.冰凍干燥保存：可保存冰凍干燥保存：可保存35年年特異性抗體的純化特異性抗體的純化1.親合層析法：親合層析法：將交叉抗原交聯到將交叉抗原交聯到Sepharose 上，裝柱后，將預吸收的抗體通過親合層上，裝柱后，將預吸收的抗體通過親合層

24、析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液則是特異析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液則是特異 性抗體。性抗體。2.吸附法：吸附法：利用不含特異性抗原的抗原液，直利用不含特異性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原則與抗體結合，上接加到免疫血清中，抗原則與抗體結合，上 清液則為無雜抗體的單價特異性抗體。清液則為無雜抗體的單價特異性抗體。特異性特異性IgG抗體的純化抗體的純化1.鹽吸沉淀法：鹽吸沉淀法：經硫酸銨鹽析提取經硫酸銨鹽析提取球蛋白球蛋白 3次，基本為次，基本為IgG類抗體，但不純。類抗體，但不純。2.A蛋白親和層析：蛋白親和層析：SPA與與IgG的的Fc段有很強的段有很強的 特異性的親和力，細菌表面不

25、同位點獨立地特異性的親和力，細菌表面不同位點獨立地 與抗體結合，一個與抗體結合，一個A蛋白至少可以結合二個蛋白至少可以結合二個 IgG分子。適合純化細胞培養上清中的分子。適合純化細胞培養上清中的McAb。3.其它：其它：凝膠過濾、離子交換層析等凝膠過濾、離子交換層析等特異性抗體的鑒定特異性抗體的鑒定1.抗體效價的鑒定：抗體效價的鑒定：即為抗體活性滴定即為抗體活性滴定2.抗體特異性鑒定抗體特異性鑒定 細菌類抗原的抗體用凝集試驗細菌類抗原的抗體用凝集試驗 可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴散試驗可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴散試驗3.抗體的純度鑒定：抗體的純度鑒定：免疫電泳分析法免疫電泳分析法4.抗體親和

26、力鑒定：抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好親和力高則靈敏度好親合力親合力l親合力是指抗體與結合抗原的活度或牢固度。抗體與抗原結合疏松，結合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。l親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結合位點與抗原的決定基之間的立體結構型的合適程度決定的。l親合力常以親合常數K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。l在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/H，H是最小檢出量，通常，K的范圍在1081012L/mol之間。 單克隆抗體技術單克隆抗體：單克隆抗體：由由B細胞雜交瘤產生的只識別抗原細胞雜交瘤產生的只識別抗原分子上一種抗原決定簇的

27、抗體分子。分子上一種抗原決定簇的抗體分子。 雜交瘤技術的原理及流程lHAT培養基是含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培養基。在氨基蝶呤(二氫葉酸類似物)存在下，這種酶缺陷的細胞不能通過核苷酸合成旁路合成次黃嘌呤和胸苷。l制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細胞變異株與脾臟的B細胞融合。l融合的雜交瘤細胞由于脾淋巴細胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細胞大量繁殖而被篩選出來。B淋巴細胞在一般培養基中不能長期生長，一般于二周內均死亡。lPEG：聚乙二醇單克隆抗體的特性單克隆抗體的特性l高度均一性高度均一性 純度很高的均一性抗體純度很高的均一性抗體l高度專一性高度專一性 只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應l 大量產生及穩定性大量產生及穩定性 雜交瘤細胞能在體內外無限繁殖并傳代雜交瘤細胞能在體內外無限繁殖并傳代