1、技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區李冰路 151 號（201203）circRNA 研究概述背景：環形 RNA 是 mRNA 在剪接的過程中，上游 exon 的 5端與下游 exon 的 3端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環狀 RNA 分子。 近來的研究表等動物狀 RNA 的種類和含量遠遠超過預期。最近的研究發現 circularRNA 可以作為“microRNA 海綿”，競爭結合 microRNA 從而解除這些 microRNA 對其他靶標的調控；同時保守型分析發現環狀 RNA 上潛在具有多種 RNA 結合蛋白的結合位點，暗示 circular RNA 可以調控 RNA 結合

2、蛋白的功能。更為重要的是，circular RNA 的表達呈現出很強的組織特異性，暗示這些 circular RNA 具有重要的生物學功能。但目前對 circular RNA 的研究剛剛起步，這類 RNA 的生物學功能還有待挖掘，因此是一個值得深入的研究方向。circRNA 概述Circular RNA (circRNA) 叫做環形 RNA，是一種新的內源性非編碼 RNA，作為 RNA的新成員成為研究熱點。不像線性 RNA 那樣有 5帽子結構和 3尾巴結構，circRNA 是閉合的環狀結構，沒有 5-3極性和聚核苷酸的尾巴結構 1。在腫瘤在內的多種疾病的研究中，發現其與疾病的潛在關聯，并在其中

3、發揮重要的調控作用，有巨大的潛力成為新伯豪生物型的臨床診療靶標。最初，在二十世紀七十年代，在 RNA中 circRNA 被首先發現，但是其表達水平低下，當時被認為是由于可變剪切（alternative splicing）出錯形成的，甚至被認為是實驗操作因素或是遺傳異常造成的，沒有被學術界重視。但是，隨著 RNA 測序技術和生物學的發展，顯示在哺乳動物細胞中大量 circRNA，其表達豐富、成內源性、3-5。結構保守且CircRNA 由特殊的末端反向互補的前體 mRNA 可變剪切，并首尾環化形成環狀 RNA。其剪接形式多種，主要可分為外顯子環化（ exon circularization）和內含

4、子環化（intron circularization）。其中外顯子環化 circRNA 有兩種形成模型：套索驅動的環化（ lariat-driven circularization）和內含子配對驅動的環化（intron-pairing-driven circularization）。circRNA 有以下一些特性：1.由于其閉合環狀結構使其比線性 RNA 更，不易被RNA 酶降解。 2.circRNA 有豐富的多樣性。 3. CircRNA 多包含外顯子，主要定位于細胞質并可能有 miRNA 響應元件（miRNA response elements, MREs）。4.具有時空特異性。5.Cir

5、cRNA 多數為內源性，少數外源性。6.不同物種之間 circRNA 進化保守 7。關于 circRNA 的功能研究有幾個方面，最主要的一個是認為 circRNA 參與轉錄后調控， 其類似于一個內源性 RNA 或 miRNA 的海綿，可以競爭性的抑制 RNA/miRNA 的轉錄調控。除此之外，circRNA 還可以通過抑制轉錄起始位點調節可變剪切或轉錄。此外，circRNA還可以調節其親緣基因的表達 7。1 / 5技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區李冰路 151 號（201203）研究發現 miR-7 與腫瘤的起始和進展密切相關。Li 等人發現在食管鱗癌中 cir-ITCH 有顯

6、著的下降，通過分析推測其可能和 miR-7，miR-17 和 miR214 之間有相互作用，上調ITCH 水平，這會促使泛素化介導的 Dvl2 降解，降低原癌基因 cmyc 的表達，這個過程會抑制 wnt 信號通路起到抑制腫瘤的效果。一項結腸癌的 RNA 測序研究發現多種circRNA 在腫瘤組織中表達下降。Ghosal 等人對一系列 miRNA-circRNA 作用組有關的基因進行 GO 分析，發現其主要富集于光敏感和細胞周期調控有關的進程中，其中 22 個基因與乳有關，其他還有多個基因與宮頸癌和胃癌有關，有 12 個基因在口腔癌中顯示與DNA 損傷有關 14。這也是第一個對 circRNA

7、 和腫瘤進行一個全面性的潛在圖譜分析。CircRNA 是 RNA中有一個值得關注的熱點，盡管目前人們對其了解還很淺，距離闡明其機制還相當遙遠，但是其通過參與轉錄調控，豐富了人們的認知。其時空特異性和性使其能夠成為良生物標志物；而其與腫瘤的關聯，可望成為潛在的臨床診療標志物，具有巨大的應用前景。circRNA 特點1.2.大多于細胞質中，且序列高度保守；狀 RNA 較，半衰期在 48h，其他 mRNA（線性）半衰期約細胞或組織伯豪生物為 10h。3.4.5.不同細胞中表達的環狀RNA 可能不同；同一個基因可能即產生線性 mRNA，又可以轉錄成環狀RNA;總量估計，外顯子環狀 RNA（exonic

8、 circRNA）的量約為 polyA mRNA（線性 mRNA） 的 1%；占所有非核糖體RNA 的 0.8%；大部分為 ncRNA。6.樣本要求1.細胞樣本：實驗組與對照組，至少5對5以上樣本，在實驗前請確認實驗組與對照組外在生物學表型，或者有其他指標來確認實驗組與對照組有顯著性差異。樣本保存：（1）貼壁細胞貼 壁細胞培養后先去除培養液，然后按每10cm2細胞加入2mL TRIzol試劑,緩慢旋轉培養瓶數次，充分溶解細胞。接下來將溶液轉移到RNase-的試，用移液器進行反復細胞，直至看不見成團的細胞塊，使之充分溶解于TRIzol 中形不粘稠的液體。轉移至凍存管保干冰或者-80冰箱中。（2）

9、懸浮細胞 懸浮細胞相比貼壁細胞不同在于，離心去除培養液后用PBS 緩沖液快速洗兩次，離心除去PBS 緩沖液。然后按每5×106 個細胞加1 mL TRIzol 試劑，用移液器進行反復細胞直至看不見成團的細胞塊，使之充分溶解于TRIzol 中形不粘稠的液2 / 5技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區李冰路 151 號（201203）干冰或者-80冰箱中。需要每個樣本純化前至少 2 微克 (g)體。轉移至凍存管保總RNA量需求：2. 組織樣本：癌與癌旁，疾病組織與正常組織，至少8對8以上樣本，在實驗前請確認疾病表型，其他任何臨床指標請注意收集整理。首先準備好用于包裝樣本的鋁箔

10、或冷凍保存管，并且用油性記號筆在鋁箔或凍存管外表多處寫明樣本編號。然后準確切除所需組織后，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。再在RNase-的生理鹽水中迅速漂洗樣本，以去除血漬和污物。最后用準備鋁箔或冷凍保存管裝載包裹組織，迅速投入液氮冷卻。總RNA量需求：3. 全血樣本：全血（建議采用 PAXgene 管抽取全血。使用淋巴細胞分離液或紅細胞裂解液會使活細胞處于應激狀態，從而影響細胞的基因表達）需要每個樣本純化前至少 2 微克 (g)PAXgene Blood RNA Tube 收集( Preanalytic,# 762165)伯豪生物注：*如 PAXgene Blood RN

11、A Tube 為唯一采，需先抽少量血入廢棄管內； 否則PAXgene Blood RNA Tube 為抽血程序中的最后一支試管。EDTA管收集3 / 5RNAmiRNADNATRIzolmirVana miRNA Isolation kitDNeasy Blood and Tissue kit步驟1使用標準靜脈穿刺技術全血至EDTA管；步驟2顛倒管8-10次，充分混勻EDTA和全血；RNAmiRNAPAXgene Blood RNA KitPAXgene Blood miRNA Kit步驟1平衡PAXgene Blood RNA Tube至18°C 25°C ，標記編號；步

12、驟2使用標準靜脈穿刺技術采血至PAXgene Blood RNA Tube中*，限量2.5mL；步驟3采血后，等待至少10秒鐘，以確保血液停止流入PAXgene Blood RNA Tube中；步驟4顛倒混勻PAXgene Blood RNA Tube 8-10次；步驟5豎立于金屬絲管架內，18°C 25°C 下放置至少2小時，最長不超過72小時，盡量在24小時內；步驟6轉移至- 20°C 冰凍24小時；步驟7轉移至-80°C 冰箱中保存。技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區李冰路 151 號（201203）血漿注：*該可能會去除顆粒檢測平臺

13、：BC hum參數：rcRNA array V1.0/SBC human ceRNA array V1.0ceRNA參數：數據庫來源:Circbase（88371）GENCODE v21 /Ensembl(18,100)4 / 5格式探針長度環裝RNA 數目IncRNA 數目mRNA 數目4×180K60nt883717710318853血漿miRNADNAmirVana PARIS KitQIAamp Circulating Nucleic Acid Kit步驟1外周血2 mL；外周血5mL；步驟2采血時間為早晨或上午，迅速轉至EDTA,渦旋混勻；步驟3在1小時（室溫條件下）或2小

14、時(4°C伯條件下)內，820g豪，4°C ，離心10生分鐘；在1小時（室溫條件下）或2小時(4°C 條件下)內 1,600g，物4°C ，離心10分鐘；步驟44吸取上清轉至RNase-的離心，16,000 g，4°C 離心10分鐘；步驟5吸取上清轉至RNase-的離心，2,500 g，4°C, 離心10分鐘；步驟6吸取上清至RNase-的凍存，-80°C 冰箱中保存。步驟3紅細胞裂解液：采血后或4°C 保存24小時內裂解； 淋巴細胞分離液：采血后立即分離；-20°C 冰箱中保存。步驟4收集白細胞或淋巴細胞(具體操作參見購買試劑說明書)步驟5加入1mL TRIzol（23mL Blo