1、水蛭對熱刺激后血管壁增厚的干預作用    (【摘要】 目的 探討水蛭對熱刺激后動脈管壁增厚的干預效果。方法 使用局部熱刺激兔耳，溫度為(43±0.5)，每次3h，每天1次，共做3次。模型組分別于造模后1周、2周、4周時取材；水蛭組實驗前3天及實驗后一直用水蛭灌胃，0.3g/(kg·d)，分別于造模后1周、2周及4周時取材。采用光學顯微鏡及圖像分析儀進行形態學觀察。結果 模型組熱刺激后動脈中膜成分增殖并突入血管腔內，造成管腔變狹。 造模處平滑肌細胞層數及中膜厚度增加。水蛭組與模型組相比，增殖程度減小，各項觀測指標均有不同程度的變化，但統

2、計學分析差異無顯著性。結論 0.3g/(kg·d)劑量的水蛭對熱刺激后血管壁增厚的干預效果不理想。 【Abstract】 Objective This study was designed to build a new experimental model of proliferation of arterial smooth muscle cells(SMC).Methods The central artery of the rabbit ear was heated by(43±0.5) for 3 hours a day，and for three days.We

3、examined the morphological changes of the arterials by light microscopy and digital planimetry，3 days，1 week，2 weeks，and 4 weeks after experiment. Hirudo powder was administered 3 days before heating，and rabbits were examined 4 weeks after experiment.Results As the increasing of the time，the prolife

4、ration of SMC increased and extended to the lumine of the artery，but the internal elastic membrane was not disrupted. So，the lumina stenosis occuerd. Hirudo powder caused the proliferation of SMC to decrease. Although the lumina become smaller，the effect is not significant.Conclusion From the resear

5、ch results above，we can draw the conclusion that heat can induce arterial SMC to proliferate，and then decrease the area of the artery lumina. The model is available. Heat can activate autocrine growth of the local SMC，and alter the structures and function of vascular wall. originated from the host.

6、Hirudo powder has a slight effect on decreacing SMC proliferaton，because it may not play a part in the relavent mechanism of heat. 【Key words】 artery； stenosis； Hirudo powder； morphology 水蛭是應用已久的活血祛瘀類藥物，味咸苦，性平、有小毒，歸肝經。其主要功效為破血逐瘀。臨床廣泛應用于心腦血栓性疾病及瘀血經閉的治療中，亦可用于治療生殖系統疾病如精不液化等。本實驗研究水蛭對家兔熱刺激后血管壁增厚的干預作用，現報告

7、如下。 1 實驗材料 1.1 實驗動物 中國家兔48只，體重1.82.2kg，雄性，由湖南中醫學院實驗動物中心提供。合格證號為湘醫動字第20-003號。 1.2 藥物與試劑 水蛭購自湖南長沙九芝堂藥店，產地為山東，寬體金線蛭，生產日期為2005年1月。 1.3 儀器 GSY型恒溫水浴鍋(北京醫療器械廠)； 數字彩色圖像分析儀 (美國Optimas公司)； Olympus BH2顯微鏡（日本Olympus公司產）；局部加熱器 （湖南中醫學院組織胚胎學實驗室）。 2 實驗方法 2.1 實驗動物分組 48只家兔隨機分為左耳模型組和右耳模型組，每組24只。一只耳朵造模，另一只耳朵為假處理。再將上述兩組

8、動物分別隨機納入6組，使每組含有8只動物，即左、右耳造模各4只。模型組分為3個，水蛭灌胃組為3個，分別在熱刺激后3天、1周、2周、4周時處死取材。 2.2 造模及灌胃法的實施 從耳根部起至耳尖部，測量兔耳中央動脈的長度，選取中央2cm的長度作為受試部位。將加熱器置于受試部位，以膠布固定，使之緊貼皮膚。加熱器為0.3mm厚的鐵皮制成的小圓匣，直徑2cm，高1.3cm；側面開2個小孔，分別接入水管和出水管。熱水流速為156160ml/min，流入前溫度為(43±0.5)，流出后溫度為4142。假處理組僅給予同樣的器具操做，溫度與室溫一致，時間均為每次3h，每天1次，連續做3次。水蛭組熱刺

9、激前3天及熱刺激后一直給予水蛭粉灌胃。0.3g/(kg·d)，分2次于上、下午灌胃。每次劑量溶于3ml蒸餾水中，灌入后再灌2ml蒸餾水，以使胃管壁不殘留藥末。所有動物均以普通兔飼料喂養。 2.3 標本的采集及處理 按預定日期空氣栓塞法處死動物，石蠟切片法，用地依紅染彈性纖維，再用Harris蘇木素染細胞核，最后用伊紅染膠原纖維及細胞質。 2.4 觀測指標均為光鏡下觀測1 (1)內彈性膜的完整性：在10×40倍放大的條件下，觀察所有切片內彈性膜是否有斷裂。(2)血管腔面積的測定：10×10倍放大條件下，使用圖像分析儀進行測量，標本選取及計算法同上。(3)中膜厚度的測

10、量：10×40倍放大條件下，線型測微尺進行測量（每小格為25m）。選取中膜最厚處為中心點，然后從中心點開始，將動脈橫截面等距離分成五段。分別測出5個均分點（包含中心點在內）處的中膜厚度，取均值。標本選取及計算法同上。(4)血管壁平滑肌細胞層的計數：10×10倍放大條件下，在上述5個點分別測量平滑肌細胞層數，取均值。標本選取及計算法同上。 3 統計學方法 所有數據以均數±標準差(x±s)表示。多組均數比較進行方差齊性檢查，方差齊采用方差分析、方差不齊采用tD檢驗，兩組均數比較采用t檢驗。所有數據經SAS6.12軟件進行處理。 4 結果 4.1 一般情況觀察

11、 實驗后模型組兔耳局部輕度發紅，持續2035min，對照組無變化。所有動物耳部皮膚無潰爛及腫脹。兔子毛發有光澤，活動、進食及二便均未見異常。無生病及中途死亡發生。 4.2 血管相關性指標的觀察 結果見表1、2、3。模型組中膜有不同程度的增生。所有受檢標本均未見內彈性膜斷裂。熱刺激后3天可見局部內彈性膜厚度，向管腔內突入；1周后，模型組的局部中膜增厚，增生物主要由VSMC及膠原纖維構成。2周、4周時局部中膜繼續增厚，管腔進一步縮小。 表1 家兔不同時間管腔面積測量 （×10-2mm2，x±s） 注：與同期假處理組相比，*P<0.05；與模型組28天相比，P<0.0

12、5；與水蛭組3天相比，P<0.05；與水蛭對照組28天相比，P<0.05 表2 家兔不同時間血管中膜厚度測量 （m，x±s） 注：與同期假處理組相比，*P<0.05；與模型組28天相比，P<0.05；與水蛭組3天相比，P<0.05；與水蛭對照組28天相比，P<0.05 模型組與同期假處理組相比，管腔明顯縮窄（P<0.05）。模型組4周后管腔面積明顯<3、7天組，見表1；假處理組內彈性膜光滑完整，局部中膜無增厚，管腔面積間相比差異無顯著性，見表1。 模型組中膜厚度隨動物熱刺激后生存時間的延長而增加，提示損傷后管壁的厚度在一定時間內有增加的

13、趨勢見表2。平滑肌細胞的層數隨動物熱刺激后生存時間延長而增加，提示熱刺激后平滑肌細胞在28天內始終保持增殖狀態，見表3。 表3 家兔不同時間血管壁平滑肌層數測量 （層/管腔，x±s） 注：與同期假處理組相比，*P<0.05；與模型組28天相比，P<0.05；與模型組14天相比，P<0.05；與水蛭對照組28天相比，P<0.05；與水蛭組3天相比，P<0.05 水蛭組各項指標的變化趨勢與模型組類似，但變化幅度相對較小，與同期模型組相比，統計學差異無顯著性。提示0.3g/kg水蛭對模型的干預效果不理想。 5 討論 水蛭是應用已久的活血祛瘀類藥物，味咸苦、性平

14、、有小毒，歸肝經。其主要功效為破血逐瘀，并可墮胎。臨床廣泛應用于心腦血栓性疾病及瘀血經閉的治療中，亦可用于治療生殖系統疾病如精不液化等。 本研究使用兔耳皮膚局部熱刺激法，造成兔耳中央動脈中膜平滑肌細胞增殖，管腔狹窄。水蛭對此病理變化的干預效果較差，除了藥物劑量和制劑的問題，可能與其所含成分有關。水蛭分離出的活性成分大致可分為兩大類：一類直接作用于凝血系統的成分，包括凝血酶抑制劑，以及其他抑制血液凝固的物質，如水蛭素(Hirudin)；第二類是其他蛋白酶抑制劑及其他活性成分，如溶纖素(Hementerin)等2。水蛭素是水蛭的主要活性成分，是目前已知的最強的凝血酶抑制劑。水蛭素可與凝血酶形成復合

15、物，阻斷凝血酶的蛋白質水解功能，不僅阻止了纖維蛋白凝塊形成，而且阻止凝血酶催化的其他凝血反應：如對凝血因子、的激活以及凝血酶誘導的血小板聚集和釋放。因此，水蛭的主要作用為抗血栓，表現為大大降低血小板和纖維蛋白形成的凝塊，而不改變血小板數量和纖維蛋白含量3。 家兔股動脈形成粥樣斑塊后，應用氣囊法形成術后，立即給予肝素和水蛭素，結果水蛭素組的再狹窄明顯降低，療效優于肝素組，表明水蛭具有一定的抗平滑肌細胞增殖的作用，但是該作用的發揮機理可能與其抗血栓作用關系密切。由于熱刺激后局部血管壁未見血小板聚積和血栓形成，所以我們推測管壁的增厚與血小板和血栓的關系不大。熱應激激活血管局部的自/旁分泌性增殖。研究

16、表明：急性熱應激能使血中血管緊張素明顯升高4。由于血管平滑肌細胞具有分泌血管緊張素原的功能，且含有血管緊張素轉換酶，所以我們推測熱刺激可使受熱局部平滑肌細胞分泌過多的血管緊張素，通過自旁分泌途徑直接作用于平滑肌細胞；也可通過間接作用激活其他生長因子，如PDGF-A 、ET1、FGF等，共同作用于平滑肌，促進其增殖及合成基質5。此外，當局部熱刺激時，滋養血管平滑肌交感神經受熱刺激，緊張度降低5，可以引起滋養血管擴張，血流量增加6。同時，由于所支配的動脈受熱擴張，局部血管內壓力升高，平滑肌舒張，動脈壁變薄，會使滋養血管受到中膜和外膜的擠壓作用而扭曲7，管腔縮窄，血流減慢，血流量降低。后者的作用抵消

17、并大于前者的作用，故使中膜血液供應量降低，造成中膜缺血缺氧。缺氧可以誘發平滑肌增殖8，缺血可以促進新內膜的產生。由于水蛭并不能作用于上述病理環節，因此對熱刺激后引起的動脈管壁狹窄的干預作用較差。 【參考文獻】 1 張均田. 現代藥理實驗方法. 北京： 北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1998，1268-1269. 2 李艷玲，黃榮清，崔玉芳.水蛭的研究概況及展望. 科學技術與工程，2004，4(3)：239-243. 3 汪鐘，鄭植荃. 現代血栓病學. 北京：北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1997，499-503. 4 陳忠，李書珍，朱劍琴. 急性熱應激小鼠血漿心鈉素、血

18、管緊張素及其體液Na+/K的變化.動物學研究，1999，20：11-13. 5 Bradford C，Berk.Vascular smooth muscle growth ：autocrine growth mechanism.Physiological Review，2001，81(3)：999-1030. 6 DD Heistad，ML Martins.Effects of neural stimuli on flow through vasa vasorum in dog. Circulation Research，1979，45： 615-620. 7 Guohong Li，Shi Juan Chen. Direct in vivo evidence demonstrati